Sampel darah yang digunakan untuk analisis hemoglobin adalah whole Blood sebanyak 20 µ l, sedangkan sampel darah yang digunakan untuk analisis kadar feritin dan kadar hepsidin adalah berupa serum masing-masing sebanyak ± 300 µ l dan ditambah untuk back up sampel serum 300 µ l sehingga darah yang diambil adalah ± 2,5 ml.
Pengambilan darah vena untuk memperoleh darah sebanyak 2,5 ml adalah sebagai berikut:
Alat-alat dan Bahan
Alat-alat yang diperlukan untuk pengambilan darah adalah spuit 2.5 ml, jarum ukuran 23 G, alkohol swab 70%, tabung centrifugasi, tabung serum, handyplast, label nama, tourniquit, rak tabung, dan cool box.
Cara pengambilan contoh darah
Pertama-tama disiapkan alat-alat dan bahan-bahan untuk keperluan pengambilan darah. Diperhatikan vena yang akan ditusuk, letaknya yang supervisial dan cukup besar, selanjutnya tourniquit dipasang pada lengan atas, jangan terlalu kencang dan tidak boleh terlalu lama. Tempat yang akan ditusuk didesinfeksi dengan alkohol 70 % kemudian vena ditusuk perlahan-lahan. Bila berhasil akan terlihat darah memasuki spuit, kemudian zuiger ditarik perlahan-lahan sampai didapatkan jumlah darah yang diinginkan. Setelah itu tourniquit dilepaskan dan sepotong kapas steril yang kering ditempatkan pada tempat penusukkan tadi, lalu jarum dikeluarkan perlahan-lahan. Responden diminta untuk
meneruskan menekan kapas tadi selama 2-3 menit sambil lengan direntangkan kemudian bekas tusukkan tadi ditutup dengan handyplast.
Jarum dilepaskan dari spuitnya lalu darah dimasukkan ke dalam botol/ tabung perlahan-lahan supaya tidak menimbulkan buih dan sebaiknya dialirkan melalui dinding tabung atau botol. Bila digunakan anticoagulant segera dikocok perlahan-lahan agar tercampur rata. Selanjutnya bekas jarum dibuang pada tempat yang sudah disediakan dan tidak boleh dicampur dengan sampah yang lain. Darah yang sudah didapat disentrifugasi dan diambil serumnya, serum dibagi menjadi tiga dan dimasukkan ke dalam tabung serum, masing-masing untuk analisis kadar feritin, kadar prohepsidin dan untuk cadangan, masing-masing tube serum diberi nama responden dan tanggal pengambilan atau kode yang sudah dibuat untuk masing-masing responden, kemudian dibawa ke laboratorium untuk dianalisis. Apabila tidak langsung dianalisis maka harus disimpan pada suhu -20 0C atau -70
0
Analisis hemoglobin
Sampel darah yang digunakan adalah whole blood sebanyak 20 µl dari darah vena yang diambil bersamaan dengan darah vena untuk analisis kadar feritin serum dan kadar prohepsidin serum. Darah yang sudah didapat dari vena sebelum dibiarkan membeku dan dicentrifugasi untuk diambil serumnya, terlebih dahulu diambil sebanyak 20 µ l untuk pemeriksaan hemoglobin, dilakukan duplo (2 analisis) agar lebih akurat. Kadar hemoglobin diukur pada panjang gelombang 546 nm menggunakan spektrofotometer HUMALYZER type 840 dilakukan di laboratorium Puslitbang Gizi dan Makanan Bogor. Pereaksi kit yang digunakan untuk pemerikasaan hemoglobin adalah merek HUMAN dari German siap pakai dengan menggunakan metode cyanmethemoglobin.
C stabil sampai ± 6 bulan.
Prinsip reaksi
Hemoglobin dengan larutan K2Fe(CN)6 berubah menjadi methemoglobin kemudian menjadi hemoglobin sianida ( HbCN ) oleh KCN dengan absorbansi maksimum pada 546 nm. Pengaturan pH dilakukan dengan menambah KH2FO4,
untuk mempercepat lisis eritrosit dan mengurangi kekeruhan HbCN ditambah non ionic detergent. Absorbansi warna berbanding lurus dengan konsentrasi Hb.
Alat Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan untuk pemeriksaan kadar hemoglobin adalah darah vena dan pereaksi cyanmethemoglobin sedangkan alat yang dibutuhkan adalah pipet mikro 20 µl, pipet mikro 5000 µl, tabung reaksi, rak tabung dan spektrofotometer.
Prosedur Analisis
Disiapkan 3 tabung reaksi seukuran 5 ml, masing-masing diberi label pereaksi blanko ( blk), Pereaksi standar ( std ) dan Pereaksi Sampel ( spl ), pada tabung blk diberi 5000 µ l ( 5 cc ) Pereaksi Hb Cyanida, dan tabung std diberi 20 µ l sample darah standar dan ditambah dengan 5000µ l Pereaksi Hb Cyanida dicampur hingga homogen, tabung spl diberi 20 µ l sample darah dan ditambah dengan 5000 µ l Pereaksi Cyanida, kemudian didiamkan selama minimal 5 menit pada suhu kamar, selanjutnya diukur absorbansi std dan absorbansi spl terhadap pereaksi blanko pada panjang gelombang 546 nm
Analisis Feritin
Kadar feritin dianalisis dengan menggunakan EIAgen Feritin merek ADALTIS dari Milano Italy Cat:
Prinsip Reaksi
LI4023 96 test, dengan metode ELISA. Analisis feritin dibaca dengan alat Microplate readermerek BIO-RAD Model 680 Series. Dilakukan di laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia IPB Bogor.
EIAgen Feritin Kit berdasarkan pada pengikatan feritin manusia dengan dua antibodi monoklonal: satu diimobilisasi pada sumur mikroplate, konjugat yang lain dengan horserasdish peroxidase (HPR). Setelah inkubasi pelepasan ikatan ditunjukkan dengan pencucian fase padat sederhana. Enzim pada fraksi ikatan bereaksi dengan substrat tetrametilbenzidin (TMB) membentuk warna biru yang berubah menjadi kuning setelah penambahan stop solution (H2SO4). Konsentrasi
feritin dalam sampel dikalkulasi berdasarkan seri kalibrator. Intensitas warna proporsional dengan konsentrasi feritin dalam sampel.
Alat-alat dan Bahan
Alat-alat yang diperlukan untuk anlisis kadar feritin adalah pipet mikro 20 µ l, pipet mikro multichannel 100 µl, dispenser otomatis, microplate reader
dengan kemampuan mengukur panjang gelombang 405, pipet tips disposible,
tissue penyerap dan kertas grafik. Sedangkan bahan yang diperlukan adalah serum sampel, serum kontrol, aquadest, Microplate dengan 12 x 8 sumur yang di coated
dengan antibodi monoklonal anti-feritin yang dapat dipatahkan, 6 vial kalibrator yang mengandung 0, 5, 20, 100, 400, 1000 ng/ml feritin hati manusia dengan gentamicin 0,01% sebagai pengawet, Conjugate yang mengandung antibodi monoklonal anti-feritin yang berkonjugasi dengan horseradish peroksidase
(HRP), substrat yang mengandung campuran 0,25 g/l TMB (tetrametilbenzidin) dan H2O2 (hidrogen peroksida), Stop Solution yang mengandung H2SO4
Preparasi Pereaksi
Larutan pencuci diencerkan 1:19 dengan aquadest, contoh : 25mL larutan pencuci + 475 mL aquadest. Stabil sampai tanggal kadaluarsa setelah diencerkan.
0,3 M, Buffer pencuci 20x yang mengandung 50 ml konsentrat bufer pencuci yang mengandung bufer fosfat 50 mM pH 7,4 dan tween 201 g/l
Prosedur Analisa
Semua pereaksi harus berada pada suhu kamar (18-250
Pertama-tama dipipet 20 µ l tiap kalibrator dan sample ke dalam masing-masing sumur yang sudah diberi nomer, lalu dipipet 100 µl konjugat ke dalam semua sumur dengan menggunakan pipet mikro multichannel. Setelah itu diinkubasi 60 menit suhu ruang (22-28
C) sebelum digunakan, dan semua pereaksi harus dikocok perlahan sebelum digunakan jangan sampai berbusa, untuk kurva standar harus disiapkan masing-masing dua sumur, satu sumur untuk blanko dan dua sumur untuk masing-masing sampel.
0
C), kemudian dicuci dengan Microplate Washer atau dengan pipet mikro multichannel sebanyak 3 kali dengan isi tiap
sumur 300 µ l. Setelah selesai buang sisa cairan dengan tisue pembersih. Selanjutnya dipipet 100 µ l substrat ke dalam tiap sumur lalu diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu ruang (22-280
Analisis Prohepsidin
Pereaksi yang digunakan untuk analisis prohepsidin adalah pereaksi
DRG® Hepcidin Prohormone ELISA (EIA-4644) dari Amerika Serikat untuk penentuan kadar prohepsidin dalam serum dan urin manusia. Metode yang digunakan adalah metode ELISA. Analisis Prohepsidin dibaca dengan alat
Microplate readermerek BIO-RAD Model 680 Series. Dilakukan di laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia IPB Bogor.
C) pada tempat gelap. Terakhir dipipet 100 ul Stop Solution ke dalam tiap sumur, goyang 5 detik dan dibaca plate dengan
Microplate Reader pada 450nm.
Prinsip Analisis
DRG Hepcidin Prohormone ELISA Kit adalah enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) fase padat, berdasarkan pada prinsip pengikatan kompetitif. Sumur-sumur mikrotiter dilapisi dengan antibodi poliklonal langsung pada sisi antigenik molekul prohepsidin. Prohepsidin endogenus dari sampel pasien bersaing dengan konjugat biotin prohormon hepsidin untuk berikatan pada antibodi yang dilapisi pada sumur-sumur microplate. Setelah inkubasi konjugat yang tidak terikat dicuci. Jumlah yang terikat dengan konjugat biotin adalah berbanding terbalik dengan konsentrasi prohepsidin dalam sampel. Setelah penambahan larutan substrat intensitas warna yang terbentuk berbanding terbalik dengan konsentrasi prohepsidin dalam sampel
Alat-alat dan bahan
Alat-alat yang digunakan dalam analisis ini adalah: 1. pipet mikro 50 µl, 2. pipet mikro multichannel 100 µ l, 3. dispenser otomatis, 4. microplate reader
dengan kemampuan mengukur panjang gelombang 405, 5. pipet tips disposible, 6. tissue penyerap dan 7. kertas grafik. Sedangkan bahan yang digunakan adalah: 1. serum sampel, 2. serum kontrol, 3. Microtiterwells, 12x8 (dapat dipatahkan) strips
96 sumur yang sudah dilapisi dengan antibodi poliklonal anti prohepsidin, 4.
Standard (Standard 0-6) 7 vial (lyophilized), 1 mL; konsentrasi: 10, 50, 100, 250, 500, 1000 ng/mL peptida hepsidin sintetik yang mengandung < 0.02%
methylisothiazolone dan < 0.02% bromonitrodioxane sebagai pengawet, 5. kontrol, 1 vial (lyophilized) 1 mL dengan nilai kontrol dan rentangnya sesuai
dengan yang tertera di label vial, 6. Assay Buffer 1 vial 14 mL, siap pakai, mengandung < 0.02% methylisothiazolone dan < 0.02% bromonitrodioxane
sebagai pengawet, 7. Biotin Conjugate (fragment prohepsidin berkonjugasi dengan biotin, 1 vial 14 mL yang megandung < 0.02% methylisothiazolone dan < 0.02% bromonitrodioxane sebagai pengawet; siap pakai, 8. Enzyme Complex horseradish peroksidase 1 vial 14mL mengandung < 0.02% methylisothiazolone
dan < 0.02% bromonitrodioxane sebagai pengawet, 9. Substrate Solution Tetramethylbenzidine (TMB) 1 vial 14 mL siap pakai, 10. Stop Solution
mengandung 0.5M H2SO4
Preparasi Pereaksi
Diencerkan 30 mL konsentrat Wash Solution dengan 1170 mL aquades, stabil selama dua minggu pada suhu kamar.
1 vial 14 mL siap pakai, 11. Wash Solution (konsentrat 40 X) 1 vial 30 mL, 12. Aquades.
Prosedur analisis
Setiap kali menjalankan analisis harus termasuk satu seri kalibrasi. Pertama-tama harus dipastikan semua sumur mikrotiter berada pada mikrotiter holder sesuai nomornya. Dipipet 100 μl Assay Buffer ke dalam masing-masing sumur lalu dipipet 50 μl masing-masing standar, kontrol dan sampel dengan tips sekali pakai baru ke dalam tiap sumur yang sudah dinomori dan untuk masing-masing sampel harus dibuat duplo. Selanjutnya dipipet 100 μl konjugat biotin ke dalam masing-masing sumur, lalu dikocok selama 10 detik, ini penting agar tercampur homogen. Setelah itu diinkubasi selama 120 menit pada suhu kamar (tanpa menutup plate), kemudian isi sumur dibuang dengan cepat dan sumur dibilas 5 kali dengan Wash Solution (400 μl per sumur). Sumur dihentakkan dengan keras ke tissue penyerap untuk membuang sisa-sisa residu. (sensitivitas
dan ketepatan pengukuran dipengaruhi kebersihan pada saat pencucian). Selanjutnnya ditambahkan 100 μl Enzyme Complex ke masing-masing sumur, lalu diinkubasi lagi selama 60 menit pada suhu ruang. Isi sumur selanjutnya dibuang dengan cepat dan dibilas 5 kali dengan Wash Solution (400 μl per sumur). Kemudian sumur dihentakkan dengan keras ke tissue penyerap untuk membuang sisa-sisa residu, lalu ditambahkan 100 μl Substrate Solution pada masing-masing sumur. Diinkubasi kembali selama 30 menit pada suhu ruang. Reaksi enzimatik distop dengan menambahakan 100 μl Stop Solution pada masing-masing sumur dan terakhir dibaca pada panjang gelombang 450 ± 10 nmdenganmikrotiter plate reader dalam waktu 10 menit setelah penambahanStop Solution. Hasil pembacaan dihitung berdasarkan kurva standar (kalibrator).
Analisis C-Reactive Protein (CRP)
CRP adalah suatu protein fase akut yang terdapat di dalam serum manusia sebagai respon terhadap berbagai kondisi imflamasi dan nekrosis jaringan dan menghilang seiring dengan kondisi kesembuhan. CRP biasanya ditemukan pada kasus infeksi bakteri, rheumatoid fever aktif dan beberapa neoplasma yang menular dan sering berhubungan dengan kasus rheumatoid arthritis, infeksi virus, dan tuberkulosis.
Pereaksi yang digunakan untuk analisis CRP ini adalah CRP Latex Test yang diproduksi oleh Antec Diagnostic dari United Kingdom untuk analisis kulitatif dan semi kuantitatif CRP dalam serum manusia.
Prinsip Analisis
Pembacaan ditunjukkan dengan menguji suspensi partikel lateks yang di lapis dengan antibodi CRP manusia terhadap serum yang tidak dikenal. Adanya aglutinasi yang tampak mengindikasikan suatu peningkatan kadar CRP yang bermakna secara klinis yang menunjukkan kemungkinan adanya infeksi atau peradangan.
Alat-alat dan bahan
Alat-alat yang digunakan dalam analisis ini adalah: pipet mikro 40 µ l, 50 µ l dan 100 µ l, slide test, batang pengaduk (stirer pipet), tabung kecil, larutan salina, rotator dan timer. Bahan - bahan yang dibutuhkan dalam analisis CPR adalah: serum sampel yang jernih, kontrol serum positif dengan konsentrasi
ɋ 15 mg/l, kontrol serum negatif mengandung Ɋ 0,1% azide, buffer konsentrat glisin (sebelum digunakan harus diencerkan 10 kali) pH antara 8,0 – 8,2.
Prosedur Analisis Metode Kualitatif
Semua pereaksi harus dipastikan mencapai suhu kamar, kemudian kocok perlahan pereaksi latex untuk membuyarkan partikel latex yang menumpuk agar tidak mengendap. Diambil 40 µ l pereaksi latex dengan menggunakan pipet mikro, dan letakkan pada tiap lingkaran pada slide test. Dengan menggunakan stirer pipet
tambahkan satu tetes serum ke satu lingkaran pada slide test yang sudah ada pereaksi latexnya, kemudian campur dengan menggunakan stirer dan ratakan di seluruh lingkaran. Slide test dimiringkan sambil digoyang ke depan dan ke belakang perlahan-lahan selama sekitar dua menit, lalu interpretasikan hasil gumpalannya (aglutinasinya) kemudian dibandingkan dengan kontrol positif dan negatif.
Catatan:
Mereaksikan serum dengan latex jangan lebih dari dua menit karena dapat menyebabkan hasil yang salah (positif palsu). Terakhir hasil dicatat dan slide test
dicuci dengan aquadest dan dikeringkan untuk dipakai kembali.
Adanya aglutinasi mengindikasikan bahwa kadar CRP sampel sama dengan ɋ 6 mg/l (Regen Kit CRP Antec Diagnostic, 2010)
Tabel 6. Seri pengenceran CRP Pengenceran 1/2 1/4 1/8 1/16 Serum sampel 100 µl Saline 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µll 100 µl 100 µl Volume sample 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 6 x titer 6 x 2 6 x 4 6 x 8 6 x 16 Mg/ml 12 24 48 96 Metode Semi-kuantitatif
Semi-kuantitatif test dapat dilakukan seperti cara kualitatif dengan menggunakan seri pengenceran serum dalam larutan salina, bufer fosfat, atau saline glycin
dengan cara seperti pada Tabel 6. Titer CRP diperlihatkan dengan adanya aglutinasi pada pengenceran tertinggi. Misalnya jika terjadi aglutinasi pada pengenceran ke 3, titernya adalah 8 berhubungan dengan konsentrasi 48 mg/l.