a. Denaturasi karena penambahan asam asetat
Pada percobaan pertama , dilakukan penambahan asam asetat 1N pada dua larutan protein yaitu dari putih telur dan susu sapi segar.
Protein telur
Penambahan asam asetat 1 N pada larutan telur maka akan timbul endapan putih dan larutan putih keruh yang menunjukkan bahwa endapan tersebut masih bersifat sebagai protein (albumin), tetapi telah terjadi perubahan struktur tersier ataupun kwartener, sehingga protein tersebut mengendap. Kemudian dipanaskan dan endapan semakin banyak karena pemanasan akan menyebabkan protein telur terdenaturasi sehingga kemampuan mengikat airnya menurun. Hal ini terjadi karena energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi non-kovalen yang ada pada struktur alami protein tetapi tidak memutuskan ikatan kovalennya yang berupa ikatan peptida.
Protein susu
Larutan protein susu ditambah dengan asam asetat 1 N maka akan timbul endapan putih (+) yang menunjukkan bahwa endapan tersebut masih bersifat sebagai protein (triptofan,kasein), tetapi telah terjadi perubahan struktur tersier ataupun kwartener, sehingga protein tersebut mengendap. Kemudian dipanaskan dan endapan semakin banyak karena pemanasan akan menyebabkan protein telur terdenaturasi sehingga kemampuan mengikat airnya menurun. Hal ini terjadi karena energi panas akan mengakibatkan terputusnya interaksi non-kovalen yang ada pada struktur alami protein tetapi tidak memutuskan ikatan kovalennya yang berupa ikatan peptida.
Protein telur
Larutan protein telur yang dipanaskan terbentuk larutan endapan putih. Kemudian larutn tersebut dibagi menjadi dua tabung.Pada tabung 1 ditambah dengan asam asetat terbentuk larutan dengan endapan putih (++). Pada tabung 2 ditambah ammonium sulfat terbentuk larutan endapan putih (+).
Protein susu
Protein susu dipanaskan terbentuk larutan endapan putih.Kemudian protein susu yang telah dipanaskandibagi menjadi dua tabung.Pada tabung 1 ditambah asam asetat terbentuk larutan endapan putih (++) dan pada tabung 2 ditambah amonium sulfat terbentuk larutan endapan putih (+).
Dari data di atas diketahui pemanasan akan mendenaturasi protein yang ditandai dengan adanya endapan putih yang diakibatkan oleh putusnya ikatan non-kovalen sehingga berkurang kemampuan mengikat air pada protein berkurang sehingga protein menggumpal dan membentuk endapan. Penambahan ammonium sulfat akan membuat protein terdenaturasi semakin banyak yang ditandai dengan bertambahnya jumlah endapan karena ammonium sulfat bersifat sebagai agen pendenaturasi.
c. Denaturasi karena penambahan formaldehid Protein telur
Penambahan formaldehid tetes demi tetes pada protein telur menyebabkan terbentuknya endapan putih (+).
Protein susu
Penambahan formaldehid tetes demi tetes pada protein susu membentuk endapan putih yang lebih sdikit dibandingkan protein pada telur
Penambahan formaldehid akan mendenaturasi protein dikarenakan terbentuknaya derivat asama amino dimetil akibat adanya reaksi antara formaldehid dengan gugus amin pada protein. Jumlah endapan menunjukkan kuantitas protein yang terdenaturasi. Dari ketiga percobaan yang dilakukan mengenai denaturasi protein, diketahui bahwa protein akan mengalami denaturasi atau kerusakan dengan adanya beberapa perlakuan seperti penambahan asam, pemanasan, dan penambahan senyawa
organik. Kerusakan protein dapat diidentifikasi dengan adanya endapan yang dihasilkan.
2. Pengendapan Protein
a. Pengendapan protein dengan ammonium sulfat Protein telur
Setelah ditambahkan ammonium sulfat dan dikocok terbentuk larutan keruh., membentuk hablur (putih – kuning) dan endapan mengapung. Terbentuk larutan keruh karena penambahan ammonium sulfat menyebabkan terjadinya dehidrasi protein (kehilangan air). Akibat proses dehidrasi ini molekul protein mempunyai kelarutan paling kecil dan akan mudah mengendap. Protein yang diendapkan ini tidak mengalami perubahan kimia, sehingga dapat dengan mudah dilarutkan kembali melalui penambahan air.
Protein susu
Setelah ditambahkan ammonium sulfat dan dikocok terbentuk endapan putih didasar tabung. Pengendapan terjadi karena penambahan ammonium sulfat menyebabkan terjadinya dehidrasi protein (kehilangan air). Akibat proses dehidrasi ini molekul protein mempunyai kelarutan paling kecil dan akan mudah mengendap. Protein yang diendapkan ini tidak mengalami perubahan kimia, sehingga dapat dengan mudah dilarutkan kembali melalui penambahan air
Dari percobaan ini diketahui bahwa apabila terdapat garam-garam anorganik pada konsentrasi tinggi pada larutan protein, maka kelarutan protein akan berkurang sehigga akan mengakibatkan protein tersebut mengendap. Hal ini disebabkan oleh ion-ion garam berkompetisi dengan molekul-molekul protein untuk mengikat air. Karena kemampuan garam terhidrasi lebih besar daripada molekul protein, maka molekul-molekul protein akan mengendap. Protein yang diendapkan tidak mengalami perubahan kimia sehingga dapat dilarutkan kembali melalui penambahan air. Pengendapan ini bersifat reversibel.
b. Pengendapan protein dengan asam mineral Protein telur
Larutan protein telur ditambah dengan asam nitrat tetes demi tetes melewati dinding tabung terbentuk cincin putih. Kemudian dikocok terbentuk endapan yang disebabkan oleh reaksi asam dengan gugus amino pada protein Penambahan asam nitrat menghasilkan endapan yang bersifat irreversible. Pada larutan tersebut ditambah lagi dengan asam nitrat maka terbentuk larutan dengan endapan (++) berwarna putih kekuningan. Pada percobaan dengan asam klorida terbentuk cincin putih. Ketika dikocok dengan asam klorida berlebih terbentuk larutan kuning jernih. Terbentuknya endapan ini disebabkan oleh reaksi asam dengan gugus amino pada protein. Penambahan asam klorida berlebih menyebabkan endapan larut kembali. Sehingga penambahan asam klorida menghasilkan endapan yang bersifat reversible.
Protein susu
Protein susu ditambah dengan asam nitrat yang dilewatkan melalui dinding tabung terbentuk cincin putih pada bagian atas larutan . Ketika dikocok terbentuk endapan putih Terbentuknya endapan ini disebabkan oleh reaksi asam dengan gugus amino pada protein. Penambahan asam nitrat menghasilkan endapan yang bersifat irreversible. Dan ketika ditambahkan asam lagi endapan (++). Protein telur ditambah dengan asam klorida terbentuk cincin putih. Ketika dikocok terbentuk larutan putih. Terbentuknya endapan ini disebabkan oleh reaksi asam dengan gugus amino pada protein. Kemudian ditmbah asam lagi, penambahan asam klorida berlebih menyebabkan endapan larut kembali, larutan menjadi agak jernih. Sehingga penambahan asam klorida menghasilkan endapan yang bersifat reversible.
Dari percobaan tersebut menunjukkan bahwa protein yang ditambahkan dengan asam nitrat menghasilkan endapan yang bersifat irreversibel, sedangkan protein yang ditambahkan dengan asam klorida menghasilkan endapan yang bersifat reversible.
c. Pengendapan protein dengan penambahan logam berat protein telur
Setelah ditambahkan CuSO4 dan dikocok menghasilkan endapan biru , setelah ditambah CuSO4 lagi endapan kemudian larut kembali. Penambahan ZnSO4 terbentuk endapan putih (+). Penambahan FeSO4 terbentuk endapan kuning
(+). Pada pengendapan protein dengan ion logam berat, pengendapan terjadi karena ion logam berat dengan protein membentuk garam proteinat yang tidak larut dalam air.
protein susu
Setelah ditambahkan CuSO4 dan dikocok menghasilkan endapan biru muda. Penambahan ZnSO4 terbentuk endapan putih (++). Penambahan FeSO4 terbentuk endapan kuning (++). Pada pengendapan protein dengan ion logam berat, pengendapan terjadi karena ion logam berat dengan protein membentuk garam proteinat yang tidak larut dalam air.
Garam logam berat seperti Cu, Zn, dan Fe akan membentuk endapan logam proteinat. Ikatan yang terbentuk amat kuat dan akan memutuskan ikatan peptida, sehingga protein mengalami denaturasi. Secara bersama gugus –COOH dan gugus –NH2 yang terdapat dalam protein dapat bereaksi dengan ion logam berat dan membentuk senyawa kelat. Adanya perbedaan warna pada endapan yang dihasilkan berasal dari warna logam berat yang ditambahkan.
Reaksi protein dengan logam berat:
Jumlah endapan yang dihasilkan pada telur lebih banyak menunjukkan bahwa protein pada telur lebih banyak dan lebih mudah mengendap daripada protein pada susu saat pengendapan dengan logam berat. Setelah penambahan logam berat dilanjutkan, endapan yang semula terbentuk mulai larut, hal ini menunjukkan bahwa reaksi pengendapan pritein dengan logam berat bersifat reversibel, karena garam-garam logam berat ini bersifat anorganik.
3. Reaksa warna pada protein a. Reaksi biuret
Pereaksi biuret bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya gugus amida pada filtrat yang dihasilkan.
Pada saat protein telur ditambah 1 mL NaOH 40% dan beberapa tetes CuSO4 didapatkan endapan ungu (++) dan larutan berwarna ungu. Fungsi dari penambahan NaOH adalah agar suspensi protein menjadi bersuasana alkalis. Sedangkan penambahan CuSO4 berfungsi untuk menghasilkan biuret yang berwarna ungu. Hal ini dikarenakan terbentuk senyawa kompleks antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan peptide (n –CO-NH-). Warna ungu menunjukkan protein telur mengandung ikatan dipeptida.
Protein susu
Pada saat protein susu ditambah 1 mL NaOH dan 5 tetes CuSO4 didapatkan larutan berwarna ungu, dan terbentuk endapan bewarna ungu. Fungsi dari penambahan NaOH adalah agar suspensi protein menjadi bersuasana alkalis. Sedangkan penambahan CuSO4 berfungsi untuk menghasilkan biuret yang berwarna ungu. Hal ini dikarenakan terbentuk senyawa kompleks antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan peptide. Warna ungu menunjukkan protein telur mengandung ikatan tripeptida.
Dari percobaan ini warna ungu pada protein telur lebih pekat daripada protein susu. Hal ini mengindikasikan bahwa ikatan peptide dalam protein telur lebih banyak atau panjang dibandingkan dengan ikatan peptide pada protein susu. Pada protein telur mempunyai ikatan dipeptida sedangkan pada protein susu mempunyai ikatan tripeptida. Sehingga dapat disimpulkan ketika protein susu dan telur diuji dengan biuret akan menghasilkan uji positif. Reaksinya adalah sebagai berikut
b. Reaksi ksanthoprotein Protein telur
Pada saat penambahan asam nitrat dan dipanaskan terbentuk endapan putih, setelah dipanaskan kemudian endapan berubah menjadi kuning (+). Setelah ditambah amonia larutan menjadi kuning dn terbentuk cicncin kuning. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi atau reaksi substitusi atom H pada benzena yang
HC NH2 COO H H2C + NaOH + CuSO4 Na2SO4 + H2O + HC NH2 C H2C HC NH2 C H2C OH OH O O O O Cu
terdapat pada molekul protein oleh gugus nitro. Inti benzena dapat ternitrasi oleh asam nitrat pekat menghasilkan turunan nitrobenzena. Warna kuning disebabkan terbentuknya suatu senyawa polinitrobenzena dari asam amino protein. Setelah ditambahkan NH4OH terbentuk endapan kuning (++). Hal ini disebakan sifat keasaman fenol bereaksi deng an alkali.
Protein susu
Pada saat penambahan asam nitrat dan dipanaskan terbentuk endapan kuning. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi atau reaksi substitusi atom H pada benzena yang terdapat pada molekul protein oleh gugus nitro. Inti benzena dapat ternitrasi oleh asam nitrat pekat menghasilkan turunan nitrobenzena. Warna kuning disebabkan terbentuknya suatu senyawa polinitrobenzena dari asam amino protein. Setelah ditambahkan NH4OH terbentuk endapan kuning (+). Hal ini disebakan sifat keasaman fenol bereaksi dengan alkali.
Dari percobaan ini dapat diidentifikasi bahwa antara protein telur dan susu memberikan reaksi positif mengandung asam amino dengan inti benzene seperti fenilalanin, tirosin, albumin, triptofan dan lain sebagainya yang ditandai dengan terbentuknya endapan kuning.
c. rekasi ninhidrin
Ninhidrin adalah suatu reagen berguna untuk mendeteksi asam amino dan menetapkan konsentrasinya dalam larutan. Senyawa ini merupakan hidrat dari triketon siklik, dan bila bereaksi dengan asam amino menghasilkan zat berwarna ungu CH2 CH COOH H2N + HNO3 HO NO2 NO2 H2 C C H NH2 COOH
Protein telur
Penambahan reagen ninhidrin diawali dengan pengaturan pH larutan menjadi 7 kemudian pemanasan selama 10 menit maka yang terjadi adalah terbentuk larutan berwarna biru ke abu – abuan dan terdapat endapan (++). Warna yang dihasilkan menunjukkan uji ninhidrin positif, karena pada asam amino terdapat gugus karboksil yang dapat dilepaskan atau tereduksi akan bereaksi dengan NH3 dengan proses dekarboksilasi dan menghasilkan suatu amina. Gugus amino pada asam amino dapat bereaksi dengan asam nitrit dan melepaskan gas nitrogen. Asam amino, ammonia dan gugus amino primer dalam protein apabila didihkan dengan larutan protein pada pH 7 dan dengan adanya ninhidrin serta hidrindatin menjadikan larutan menjadi berwarna biru
Protein susu
Penambahan reagen ninhidrin kemudian pemanasan selama 10 menit maka yang terjadi adalah terbentuk larutan berwarnabiru (+) dan endapan berwarna biru tua (+). Warna biru menunjukkan uji ninhidrin positif, karena pada asam amino terdapat gugus karboksil yang dapat dilepaskan atau tereduksi akan bereaksi dengan NH3 dengan proses dekarboksilasi dan menghasilkan suatu amina. Gugus amino pada asam amino dapat bereaksi dengan asam nitrit dan melepaskan gas nitrogen. Asam amino, ammonia dan gugus amino primer dalam protein apabila didihkan dengan larutan protein pada pH 7 dan dengan adanya ninhidrin serta hidrindatin menjadikan larutan menjadi berwarna biru
Pengujian endapan yang dihasilkan dengan pereaksi milon bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan tirosin.
Protein telur
Setelah ditambah pereaksi millon (HgSO4 memberi suasana asam agar Hg tidak mengendap, menghidrolisis protein agar terdapat tyrosin) dan dipanaskan terbentuk endapan merah kekuningan. Setelah didinginkan dan ditambah NaNO2 (berfungsi untuk mereduksi Hg) dan dipanaskan kembali terbentuk endapan merah (++).
Protein susu
Setelah ditambah pereaksi millon (HgSO4 memberi suasana asam agar Hg tidak mengendap, menghidrolisis protein agar terdapat tyrosin) dan dipanaskan terbentuk endapan merah kekuningan. Setelah didinginkan dan ditambah NaNO2 (berfungsi untuk mereduksi Hg) dan dipanaskan kembali terbentuk endapan merah (+).
Dari percobaan ini dapat dijelaskan bahwa endapan yang dihasilkan berasal dari pengikatan Hg pada hidroksifenil yang menghasilkan kompleks berwarna merah. Dimana kompleks berwarna merah tersebut menunjukkan adanya gugus hidroksifenil (tyrosin) pada kedua protein. Percobaan yang kami lakukan sesuai dengan tujuan dilakukannya reaksi Millon yaitu untuk membuktikan adanya tirosin pada protein e. Reaksi Hopkin-Cole
Protein telur
Setelah ditambah 1 tetes formaldehid larutan protein menjadi agak kental kemudian ditambah 1 tetes pereaksi HgSO4 untuk identifikasi adanya asam amino triptofan ditandai dengan terbentuknya endapan putih kekuningan. Kemudian ditambah 1 mL H2SO4 pekat awalnya terbentuk 2 lapisan, dan pada bidang atas terlihat adanya cincin ungu, setelah digojog seluruh larutan menjadi cokelat.
Protein susu
Setelah ditambah 1 tetes formaldehid larutan protein menjadi agak kental kemudian ditambah 1 tetes pereaksi HgSO4 untuk identifikasi adanya asam amino triptofan ditandai dengan terbentuknya endapan putih kekuningan. Kemudian ditambah 1 mL H2SO4 pekat awalnya terbentuk 2 lapisan, dan pada bidang atas terlihat adanya cincin ungu, setelah digojog seluruh larutan menjadi cokelat
Dari percobaan ini dapat dijelaskan bahwa pembentukan cincin ungu setelah penambahan H2SO4 pekat disebabkan karena terbentuknya kondensasi 2 inti indol dari asam amino triptofan dengan aldehid. Aldehid diperoleh dari penambahan larutan formaldehid ke dalam protein. Percobaan yang kami lakukan sesuai dengan tujuan dilakukannya reaksi Hopkins-Cole yaitu untuk membuktikan adanya asam amino triptofan pada protein.
d. Hidrolisis protein dan tes adanya belerang Protein telur
Protein telur setelah ditambah NaOH dan dipanaskan menghasilkan endapan putih kekuningan (++), lalu ditmbah 1 tetes Pb( terbentuk endapan hitam pekat) . Penambahan NaOH akan menghirolisis ikatan peptide dari polimer protein. Hidrolisis ini menghasilkan monomer asam amino. Jika dalam protein terdapat asam amino yang mengandung atom S seperti sistein atau metionin maka menghasilkan warna hitam (++) karena atom S bereaksi dengan asam asetat membentuk endapan PbS, dengan reaksi :
Protein susu
Setelah ditambah NaOH dan dipanaskan , lalu ditambah 1 tetes Pb asetat terbentuk larutan coklat kehitaman. Penambahan NaOH akan menghirolisis ikatan peptida dari polimer protein. Hidrolisis ini menghasilkan monomer asam amino. Jika dalam protein terdapat asam amino yang mengandung atom S seperti sistein atau metionin maka menghasilkan warna hitam (++) karena atom S bereaksi dengan asam asetat membentuk endapan PbS.
Dari percobaan ini menunjukkan bahwa kandungan asam amino metionin atau sistein pada telur lebih banyak daripada susu, hal ini ditunjukkan dari perbedaan kepekatan warna hitam yang dihasilkan ketika ditambahkan larutan Pb asetat untuk membentuk endapan PbS.
J. KESIMPULAN :
a) Denaturasi protein dapat terjadi karena pH (penambahan senyawa asam atau basa) dan pemanasan.
b) Protein dapat bereaksi dengan asam ataupun basa yang ditandai dengan adanya endapan.
c) Protein dapat larut secara reversible dan irreversible.
d) Reaksi biuret dilakukan untuk mengetahui adanya ikatan peptida. Reaksi ini positif jika perubahan warna menjadi ungu setelah ditambahkan larutan CuSO4.
e) Reaksi ksanthoprotein dilakukan untuk mengetahui adanya gugus asam amino berinti benzene (albumin, triptofan) yaitu pada percobaan ini ketika asam nitrat pekat ditambahkan dan menghasilkan turunan nitrobenzene.
f) Reaksi ninhidrin digunakan untuk mengetahui adanya gugus α-asam amino. Reaksi positif apabila memberikan warna ungu. Dimana gugus α-asam amino bereaksi dengan asam nitrit dan melepaskan gas nitrogen.
g) Reaksi millon positif apabila protein yang mengandung gugus hidroksifenil (asam amino tirosin) dapat bereaksi dengan larutan mercuri nitrat dapat menghasilkan larutan atau endapan yang berwarna merah.
h) Reaksi hopkins-cole dilakukan untuk menguji adanya asam amino triptofan pada protein. Ditandai dengan adanya cincin ungu saat penambahan H2SO4 pekat.
i) Penambahan NaOH akan menghirolisis ikatan peptide dari polimer protein. Hidrolisis ini menghasilkan monomer asam amino. Dan uji belerang dengan Pb asetat pada
protein digunakan untuk mengetahui adanya asam amino sistein dan metioni, dimana mempunyai gugus S pada gugus aminonya.