II.2 Metode Kerja
II.2.6 Analisis Serum
II.2.6.5 Analisis Menggunakan KCKT (13, 24, 25)
Filtrat yang dikeringkan dilarutkan dengan 2 ml metanol pro HPLC, disaring dan dimasukkkan ke dalam vial autosampler KCKT. Sebanyak 10 µl sampel dianalisis dengan KCKT Shimadzu LC-20 AD dengan kondisi
alat sebagai berikut:
Kolom : Shim-Pack ODS C18 250 x 4,6 mm Sistem : Fase Terbalik
Fase Gerak : Metanol : Air = 70 : 30 (v/v) Laju Alir : 0,5 ml/menit
Suhu Kolom : 40oC
Detektor : Photodiode array (PDA), UV 210 nm
35 IV.1 Hasil Penelitian
Tabel 2. Profil Kromatogram Osteokalsin
Kelompok Perlakuan
Profil Kromatogram Osteokalsin
Perubahan Luas Area
(∆x02)
Frag-men
Awal Bulan (0) Bulan ke-1 (1) Bulan ke-2 (2) Waktu
Retensi (RT)
Luas Area
(x)
Waktu Retensi
(RT)
Luas Area (x)
Waktu Retensi
(RT)
Luas Area (x)
Sari Kedelai (NOV-1)
I 12,30 19.967 12,41 6.120 12,38 2.457.744 2.437.777 II 17,47 74.060 17,63 47.949 17,57 988.290 914.230 III 18,88 9.931 19,00 7.045 18,97 367.137 357.206 Jumlah 103.958 Jumlah 61.114 Jumlah 3.813.171 3.709.213
Kalsium (NOV-2)
I 12,57 139.768 12,35 21.714 12,39 1.443.222 1.303.454 II 17,82 197.693 17,53 67.032 17,59 711.169 513.476 III 19,23 89.327 18,84 11.233 18,98 253.780 59.080 Jumlah 426.788 Jumlah 99.979 Jumlah 2.408.171 2.935.489
Fortifikasi (NOV-3)
I 12,31 - 12,37 135.904 12,40 3.956.722 3.956.722 II 17,44 - 17,56 266.882 17,60 1.152.777 1.152.777 III 18,83 - 18,99 75.556 18,99 408.722 408.722 Jumlah - Jumlah 478.342 Jumlah 5.518.221 5.518.221
Aquades (NOV-4)
I 12,31 - 12,33 18.237 12,37 1.348.545 1.348.545 II 17,44 - 17,51 75.794 17,54 793.450 793.450 III 18,83 - 18,86 12.612 18,92 294.917 294.917 Jumlah - Jumlah 106.643 Jumlah 2.436.912 2.436.912
IV.2 Pembahasan
Profil kromatogram osteokalsin dalam serum tikus betina (Rattus nivergicus) pada penelitian ini diperoleh secara kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). KCKT merupakan teknik pemisahan dan analisis senyawa tertentu dalam suatu sampel baik analisis kualitatif maupun kuantitatif (8).
Pada penelitian ini dibandingkan profil kromatogram osteokalsin tikus betina (Rattus novergicus) yang telah memperoleh perlakuan berbeda selama 2 bulan, di antaranya pemberian sari kedelai (NOV-1), pemberian kalsium dari limbah cangkang telur ayam ras (NOV-2), pemberian sari kedelai yang difortifikasi kalsium dari limbah cangkang telur ayam ras (NOV-3), dan pemberian aquades (NOV-4).
Osteokalsin yang diekstraksi dari serum dengan amonium hidrogen karbonat menghasilkan tiga fragmen yang diduga sebagai fragmen dari osteokalsin, ketiga fragmen ini teridentifikasi pada waktu retensi 12 menit 31 detik, 17 menit 44 detik dan 19 menit 23 detik.
Identifikasi fragmen-fragmen ini dilakukan dengan membandingkan profil kromatogram amonium hidrogen karbonat (Gambar 12), serum yang tidak dipreparasi dengan amonium hidrogen karbonat (Gambar 11), serta serum yang dipreparasi dengan amonium hidrogen karbonat (Gambar 13).
Setelah melakukan perbandingan diperoleh lima puncak yang diduga fragmen osteokalsin karena tidak terlihat pada profil kroatogram amonium hidrogen karbonat, yaitu pada waktu retensi 10 menit 27 detik, 12 menit 31 detik, 14 menit 18 detik , 17 menit 44 detik dan 19 menit 23 detik
(Gambar 13). Penelitian yang dilakukan oleh Niiranen et al. (2002) diidentifikasi tiga puncak yang sama dengan yang diperoleh pada penelitian ini, yakni puncak dengan waktu retensi 12 menit 31 detik, 17 menit 44 detik dan 19 menit 23 detik (24). Sehingga disimpulkan bahwa, ketiga senyawa ini yang merupakan fragmen osteokalsin.
Berdasarkan analisis, kelompok perlakuan hewan coba dengan pemberian sari kedelai yang difortifikasi kalsium dari limbah cangkang telur (NOV-3) menunjukkan perubahan nilai luas area yang paling besar (∆x02=5.518.221), kemudian secara berturut-turut kelompok perlakuan dengan pemberian sari kedelai (NOV-1) dengan nilai perubahan luas area (∆x02=3.709.213), kelompok pemberian kalsium (NOV-2) dengan nilai perubahan luas area (∆x02=2.935.489) dan kelompok kontrol normal (NOV-4) dengan nilai perubahan luas area (∆x02=2.436.912).
Perbandingan kelompok perlakuan NOV-1, NOV-2, dan NOV-3 terhadap NOV-4 dilakukan untuk menilai efektivitas tiap kelompok perlakuan dalam meningkatkan kadar osteokalsin dalam serum yang dideskripsikan melalui data luas area. Osteokalsin sebagai biomarker pertumbuhan tulang akan meningkat kadarnya dalam serum jika faktor-faktor pertumbuhan tulang berada dalam jumlah yang cukup dalam tubuh.
Osteokalsin yang dihasilkan oleh osteoblas berfungsi dalam proses kalsifikasi, yakni mengendapkan kalsium ke dalam matriks tulang agar terbentuk tulang yang padat dan masif.
Gambar 8. Perbandingan Luas Area Serum Osteokalsin tiap Kelompok terhadap Kont
Perlakuan tikus betina pemberian kalsium
kalsium (NOV-3) memiliki nilai luas area yang lebih besar dari pada kontrol normal (NOV-4).
Sari kedelai isoflavonnya dapat
memiliki sifat seperti estrogen.
osteogenesis setelah berikatan dengan reseptor estrogen. Aksi tersebut mengaktivasi faktor pertumbuhan
proliferasi dan diferensiasi sel osteoblas sehingga kadar osteokalsin akan meningkat karena terjadi peningkatan jumlah sel osteoblas.
yang menyebabkan perubahan luas area p besar daripada NOV
Kelompok NOV paling rendah dibandingkan
0 1.000.000 2.000.000 3.000.000 4.000.000 5.000.000 6.000.000
Luas Area
Perbandingan Luas Area Serum Osteokalsin tiap Kelompok terhadap Kontrol Normal
tikus betina dengan pemberian sari kedelai (NOV (NOV-2) dan pemberian sari kedelai yang difortifikasi 3) memiliki nilai luas area yang lebih besar dari pada kontrol
Sari kedelai yang merupakan fitoestrogen karena kandungan isoflavonnya dapat meningkatkan kadar osteokalsin dalam
iliki sifat seperti estrogen. Estrogen dapat meningkatkan
osteogenesis setelah berikatan dengan reseptor estrogen. Aksi tersebut mengaktivasi faktor pertumbuhan yaitu IGF-I. IGF-I berperan pada proses proliferasi dan diferensiasi sel osteoblas sehingga kadar osteokalsin akan meningkat karena terjadi peningkatan jumlah sel osteoblas.
yang menyebabkan perubahan luas area pada NOV-1 dan NOV besar daripada NOV-4.
pok NOV-2 memiliki perubahan luas area osteokalsin yang dibandingkan NOV-1 dan NOV-3. Menurut Mustafa (2011),
0 1.000.000 2.000.000 3.000.000 4.000.000 5.000.000 6.000.000
1 2 3
Kelompok Perlakuan
Aquades
Kelompok Perlakuan
Perbandingan Luas Area Serum Osteokalsin tiap Kelompok Perlakuan
dengan pemberian sari kedelai (NOV-1), dan pemberian sari kedelai yang difortifikasi 3) memiliki nilai luas area yang lebih besar dari pada kontrol
yang merupakan fitoestrogen karena kandungan serum karena dapat meningkatkan aktivitas osteogenesis setelah berikatan dengan reseptor estrogen. Aksi tersebut I berperan pada proses proliferasi dan diferensiasi sel osteoblas sehingga kadar osteokalsin akan meningkat karena terjadi peningkatan jumlah sel osteoblas. Hal inilah 1 dan NOV-3 lebih
uas area osteokalsin yang Menurut Mustafa (2011),
Aquades
Kelompok Perlakuan
kadar kalsium dalam darah sangat berpengaruh terhadap aktivitas sel-sel dalam tulang yang diregulasi oleh beberapa hormon, ketika kadar kalsium dalam darah tinggi, kalsitonin akan disekresi dan menyebabkan aktivasi osteoblas, osteoblas yang teraktivasi kemudian akan menghasilkan osteokalsin yang akan mengendapkan kalsium dalam darah ke matriks tulang sehingga kadar kalsium dalam darah kembali ke rentang normal (2). Menurut Almatsier (2001) semakin tinggi kelarutan kalsium, maka akan semakin tinggi bioavailabilitasnya (18). Kalsium oksida sukar larut dalam air, hal ini menyebabkan bioavailabilitasnya pun kurang baik.
Kalsium oksida yang diberikan pada NOV-2 tidak menjamin terpenuhinya kebutuhan kalsium. Kalsium oksida yang diberikan pada NOV-2 sukar larut dalam cairan tubuh sehingga membutuhkan waktu yang lama untuk terabsorpsi dan beredar dalam sirkulasi.
Kelompok NOV-3 lebih efektif dibandingkan NOV-1 dan NOV-2.
Luas area osteokalsin perlakuan tikus betina dengan sari kedelai yang difortifikasi kalsium (NOV-3) meningkat sebesar 3.081.309, perlakuan dengan sari kedelai (NOV-1) meningkat sebesar 1.272.301 dan perlakuan dengan kalsium (NOV-2) meningkat sebesar 498.577 dari kontrol normal (NOV-4). Hal ini berarti baik sari kedelai maupun kalsium berkontribusi dalam meningkatkan kadar osteokalsin jika dikombinasi, sedangkan penggunaan tunggal sari kedelai atau kalsium memiliki efektifitas yang tidak maksimal.
Gambar 9. Perbandingan Nilai Perubahan Luas Area Perlakuan Menggunakan Kalsium, Sari Kedelai dan Fortifikasi
Luas area osteokalsin pada bulan pertama perlakuan mengalami penurunan dari awal bulan sebelum diberi perlakuan pada kelompok pemberian sari kedelai (NOV-1) dan pemberian kalsium dari cangkang telur ayam ras (NOV-2). Sedangkan pemberian sari kedelai yang difortifikasi kalsium (NOV-3) dan kontrol normal dengan pemberian aquades (NOV-4) mengalami peningkatan nilai luas area.
Gambar 10. Perbandingan Nilai Luas Area Osteokalsin Selama Dua Bulan 0
500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000
1 2 3
Luas Area
Kelompok Perlakuan
Kalsium Sari Kedelai Fortifikasi
0 1.000.000 2.000.000 3.000.000 4.000.000 5.000.000 6.000.000
1 2 3 4
Luas Area
Kelompok Perlakuan
Awal Bulan Bulan ke-1 Bulan ke-2
m
NOV-1 NOV-2 NOV-3 NOV-4
Hasil ini menunjukkan bahwa pemberian sari kedelai dan/atau kalsium memerlukan waktu lebih dari satu bulan untuk dapat memberikan efek yang maksimal. Hal ini dapat disebabkan karena ketersediaan sari kedelai dan/atau kalsium dalam sirkulasi belum terpenuhi untuk dapat memberikan efek yang maksimal. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya bahwa kalsium oksida sukar larut dalam air. Di sisi lain, Mahmudati dalam penelitiannya mengemukakan bahwa aksi biologi sel osteoblas dalam mempengaruhi aktivitas osteogenesis merupakan aksi genomik, aksi genomik melibatkan reseptor estrogen (ER) yang terletak di nukleus. Reseptor nukleus akan berikatan dengan estrogen respons element (ERE) pada target dan akan mengatur terjadinya proses transkripsi gen dan aksi genomik ini berlangsung dalam waktu yang lama (10). Oleh karena itu, pemberian sari kedelai baik pada NOV-1 maupun NOV-2 tidak menunjukkan hasil yang efektif pada bulan pertama.
42 PENUTUP