BAHA DA METODE

Alat dan Bahan

Alat<alat yang digunakan diantaranya adalah alat<alat gelas, alat penguap putar (rotary evaporator), cawan petri, inkubator, autoklaf, pipet mikro (Eppendorf), neraca analitik, lampu ultraviolet (uv), bejana kromatografi, dan kolom kromatografi.

Gambar 2 Bakteri S. Aureus

(Sumber : hartoko.files.wordpress.com). . Bakteri ini merupakan bakteri kelompok Gram Negatif, dan termasuk flora normal saluran pencernaan tetapi dapat juga menyebabkan berbagai macam penyakit pada manusia seperti infeksi pada saluran urine dan diare. Dalam suatu biakan, E. coli membentuk koloni bulat konveks, halus dengan pinggir<pinggir

yang nyata. Suhu optimum untuk

pertumbuhan bakteri ini adalah 30<37 °C. Pada umumnya berwarna putih, kadang

berwarna putih kekuningan, coklat

keemasan, jingga kemerahan atau merah berombak<ombak, basah, dan homogen (Jawetz et al. 1996).

Gambar 3 Bakteri E. coli

(Sumber: www.jpnn.com). Fraksinasi dan Kromatografi Kolom

Fraksinasi adalah prosedur pemisahan yang bertujuan memisahkan golongan utama kandungan yang satu dari golongan utama yang lain. Pemisahan jumlah dan jenisnya senyawa menjadi fraksi yang berbeda tergantung pada jenis tumbuhan. Senyawa< senyawa yang bersifat polar akan masuk ke pelarut polar, begitu pula senyawa yang bersifat nonpolar akan masuk ke pelarut nonpolar (Harborne 1987).

Kromatografi kolom merupakan salah satu teknik kromatografi yang dapat digunakan untuk fraksinasi. Eluen keluar dari kolom berdasarkan gaya gravitasi. Pada

kromatografi kolom, campuran yang

dipisahkan akan berupa pita pada kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca. Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir

melalui kolom karena aliran yang

disebabkan oleh gaya gravitasi atau didorong dengan tekanan (Rouessac & Rouessac 1994).

Kromatografi kolom biasanya dibuat dengan menuangkan suspensi fase diam atau adsorben yang berbentuk bubur dalam pelarut yang sesuai ke dalam kolom dan

dibiarkan memampat. Selanjutnya

permukaan pelarut diturunkan sampai tepat pada bagian atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam lapisan atas penjerap, dan fase gerak yang telah dimasukkan dibiarkan mengalir. Komponen campuran turun berupa pita dengan laju yang berlainan memisah dan berkumpul sebagai fraksi. Pergerakan zat relatif terhadap garis depan pelarut dalam sistem kromatografi lapis tipis dapat didefinisikan sebagai nilai Rf, yaitu perbandingan jarak tempuh zat dengan jarak tempuh garis depan pelarut.

Teknik pemisahan kromatografi kolom dapat digunakan untuk memisahkan fraksi< fraksi yang terdapat pada ekstrak kasar daun

S. trifasciata.

Gambar 4 Eksperimen dasar kromatografi

kolom (a) bahan yang

dibutuhkan (C, kolom; SP, fase stasioner; MP, fase mobil; dan

S, sampel), (b) sampel

dimasukkan, (c) proses elusi dimulai, dan (d) hasil separasi diperoleh (Rouessac & Rouessac 1994).

Alat dan Bahan

Bahan<bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun Sansevieria trifasciata yang berasal dari kebun percobaan di Kampus Lodaya IPB, Larutan NaOH 10%, FeCl3 1%, asam asetat anhidrida, etanol 95%, pereaksi Meyer, pereaksi Dragendorf, NH4OH, serbuk Mg, amil alkohol, H2SO4 pekat, HCl 2N, silika G 60 (E. Merck 230<400 mesh), pelat aluminium jenis silika gel G60F254, media Mueller<Hinton, bakteri Staphylococcus aureus Escherichia coli standar amoksisilin dan trimetoprim, cakram kosong, pelarut

organik seperti metanol, heksana,

dikolorometan, etil asetat, kloroform, dan aseton.

Penentuan Kadar Air (AOAC 2006) Sebanyak 3 g daun segar ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui bobotnya, kemudian dipanaskan dalam oven bersuhu 105 ºC selama 3 jam. Cawan didinginkan dalam eksikator selama

30 menit dan bobotnya ditimbang.

Pemanasan dan penimbangan diulang setiap satu jam sampai diperoleh bobot tetap. Kadar air dihitung dengan rumus

Kadar air (%) = × 100% (b/b) dengan

a = bobot awal sampel (g)

b = bobot akhir sampel setelah

dikeringkan (g) Ekstraksi

Daun S. trifasciata sebanyak 20 gram

dipotong<potong kecil kemudian

dikeringkan dalam oven pada suhu 60 °C. Daun yang sudah kering tersebut, setelah dihaluskan kemudian dimaserasi dengan 200 ml metanol sebanyak tiga kali ulangan (3x24 jam). Ekstrak metanol yang diperoleh

diuapkan pelarutnya dengan rotary

evaporator vakum, sehingga diperoleh ekstrak kental metanol. Sebagian ekstrak metanol digunakan untuk uji antibakteri, dan sebagian lagi untuk penapisan fitokimia yang meliputi uji alkaloid, flavonoid, saponin, triterpenoid/steroid, tanin, dan polifenol.

Perhitungan rendemen:

Rendemen ekstrak (%) = x 100%

dengan

a = bobot ekstrak (g) b = bobot sampel kering (g) ka= kadar air

Uji Fitokimia (Harborne 1987)

Saponin dan tanin. Sebanyak 0.1 g ekstrak diekstraksi dengan 10 ml akuadestilata kemudian didihkan selama 5 menit. Campuran disaring dan filtrat dibagi ke dalam dua tabung reaksi. Bagian pertama, uji saponin, filtrat didiamkan sampai agak dingin dan kemudian dikocok kuat sampai timbul busa. Bila busa stabil dalam 10 menit, maka filtrat positif mengandung saponin. Bagian kedua, uji tanin, filtrat ditambahkan FeCl3 1%, bila dihasilkan warna hijau, biru, atau hitam maka filtrat positif mengandung tanin.

Steroid dan triterpenoid. Ekstrak ditimbang sebanyak 0.1 g dan dilarutkan dengan 25 ml etanol panas (50 ºC), kemudian disaring ke dalam pinggan porselen dan diuapkan sampai kering.

Residu dilarutkan dalam eter dan

dipindahkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan Lieberman<Burchard (3 tetes anhidrida asam asetat dan 1 tetes H2SO4 pekat). Terbentuknya warna merah atau ungu menunjukkan adanya kandungan triterpenoid, sedangkan jika terbentuk warna hijau atau biru menunjukan adanya steroid. Alkaloid. Sebanyak 0.1 g sampel dilarutkan dalam 10 ml kloroform lalu ditambahkan beberapa tetes kloroform<amonia 0.05 N lalu disaring. Filtrat yang diperoleh ditambahkan 10 tetes H2SO4 2 M, kemudian dikocok sehingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam yang tidak berwarna dipindahkan ke dalam tabung reaksi lain, lalu diteteskan pada lempeng tetes dan ditambahkan pereaksi Dragendorf, Mayer, dan Wagner. Uji positif jika berturut<turut didapat endapan berwarna jingga, putih, dan coklat.

Flavonoid. Sebanyak 0.1 g ekstrak ditambahkan 10 ml air panas lalu dipanaskan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 5 ml filtrat ditambahkan 0.05 g serbuk Mg dan 1 ml HCl pekat dan 1 ml amil alkohol kemudian dikocok. Adanya flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah / jingga / kuning pada lapisan amil alkohol.

Polifenol. Ekstrak kasar ditambahkan dengan larutan FeCl3 1%. Warna hijau kehitaman yang terbentuk menunjukkan adanya senyawa golongan polifenol.

Pemilihan Eluen Terbaik

Pelat Kromatografi Lapis Tipis (KLT) yang digunakan adalah pelat aluminium jenis silika gel G60F254. Ekstrak pekat ditotolkan pada pelat KLT. Setelah kering, langsung dielusi dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan oleh uap eluen pengembang. Eluen yang digunakan adalah

eluen yang semakin meningkat

kepolarannya dari heksana, diklorometan, kloroform, etil asetat, metanol. Noda hasil elusi diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm.

Eluen yang menghasilkan spot terbanyak dan terpisah dipilih sebagai eluen terbaik. Jika lebih dari 1 eluen menghasilkan spot terbanyak dan terpisah, maka eluen<eluen tersebut dicampurkan dengan perbandingan yang sesuai sehingga diperoleh campuran eluen terbaik untuk menghasilkan spot terbanyak dan terpisah dengan baik pada pelat KLT (Houghton & Raman 1998). Uji Aktivitas Antibakteri

Pelaksanaan uji aktivitas antibakteri dilakukan secara aseptik dengan metode difusi agar cakram. Pembuatan masing< masing suspensi bakteri dilakukan dengan menyiapkan tabung reaksi yang telah berisi media larutan NaCl streril kemudian diinokulasikan dengan 1 loop biakan bakteri uji. Untuk uji aktivitas antibakteri, digunakan biakan bakteri dengan kepadatan sel 108 sel/ml. Kepadatan suspensi bakteri diukur kepadatan selnya dengan metode

standar McFarland. Biakan bakteri

kemudian dioles ke atas permukaan media Mueller<Hinton.

Ekstrak kasar dibuat pada konsentrasi 10000, 5000, 2500, dan 1250 ppm dalam

DMSO. Setelah itu, cakram kosong

diletakkan di atas permukaan agar dan ditetesi dengan 7.5 µl ekstrak. Sebagai kontrol negatif atau pelarut digunakan cakram yang telah diteteskan DMSO dan sebagai obat standar digunakan trimetoprim dan amoksisilin. Cawan petri ini diinkubasi dengan cara terbalik selama 24 jam pada suhu 37 °C. Daerah bening di sekitar kertas cakram menunjukkan uji positif atau terdapat hambatan pertumbuhan bakteri oleh zat uji. Diameter daerah bening sekeliling cakram diukur, dan dibandingkan daerah

hambatannya dengan obat standar

trimetoprim (25 µg/cakram) dan amoksisilin (25 µg/cakram).

Masing<masing fraksi hasil kromatografi kolom dan KLT juga dilakukan uji aktivitas

antimikroba dengan cara yang sama seperti terhadap ekstrak metanol S. trifasciata. Setiap fraksi dari ekstrak metanol dibuat dengan konsentrasi 4x104, 2x104, dan 104 ppm dalam DMSO.

Pemisahan dengan Kromatografi Kolom Ekstrak metanol dipisahkan dengan menggunakan kromatografi kolom. Elusi dilakukan dengan menggunakan eluen yang semakin meningkat kepolarannya, mulai dari kloroform, kloroform :metanol (9:1); (8:2) (7:3); (6:4); (5:5); (4:6); (3:7); (2:8) (1:9), dan metanol. Eluat yang diperoleh ditampung setiap 4 ml, dan dideteksi dengan KLT. Setiap fraksi yang memiliki pola KLT yang sama digabung lalu diuji kembali aktivitas antibakterinya untuk menentukan fraksi yang paling aktif.

Dalam dokumen Antibacterial Activity of Fractionated Extract of Sansevieria trifasciata (Halaman 48-51)