Halaman 1 Strategi penelitian
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam peneletian ini adalah tikus putih galurSprague dawley jantan (Pusat Studi Biofarmaka-IPB, Indonesia) dengan kondisi sehat berumur 6 minggu dengan berat 170-250 g, pakan standar (Indofeed, Indonesia), daun Murraya koenigii
dari Balai Penelitian Tanaman Tropis (BALITRO), parasetamol (Sanmol, Indonesia), dan Curliv®plus. Selain itu beberapa larutan yang digunakan adalahbuffer neutral formalin
10% (BNF 10%), xilol I, II, dan III, parafin cair, akuades, reagen ALT dan AST (Cypress), kloroform, pereaksi Dragendorf, pereaksi Meyer, pereaksi Wagner, aseton, etanol 99.8%, etanol 70%, etanol 30%, etanol bertingkat (etanol 70%, 80%, 95%, 96%), metanol (Merck, Indonesia), eter, H2SO4 pekat, asam
asetat anhidrida, NaOH 10%, FeCl3 1%,
pewarna Mayer’s Haemotoxylin, dan permounting medium.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven, penggiling,shakerorbital, uap putar, penangas air, neraca, spektrofotometer BTS-330 BioSystem, sentrifus klinis, peralatan lainnya adalah sonde, syringe, labu Erlenmeyer, pipet tetes, pipet Mohr, pipet mikro, dan cawan porselin.
Metode Penelitian Preparasi sampel
Daun Murraya koenigi, di oven pada suhu 50°C selama tiga hari. Setelah kering, dilakukan penggilingan hingga terbentuk serbuk simplisia berukuran 40 mesh. Pengeringan dilakukan agar bahan yang diperoleh tidak mudah rusak akibat mikroorganisme.
Ekstraksi daunMurraya koenigii(Rao 2005)
Metode ekstraksi yang dilakukan adalah metode maserasi. Setiap 37 gram serbuk daun dimaserasi dengan 500 mL metanol dengan suhu ruang selama 24 jam, metode tersebut
EKSKRESI EKSKRESI UDP-glukuronosil- transferase Fenolsulfotransferase Glukuronida Glutation
Glutation S-transferase N-asetil-pbenzokuinoniminaNAPKI Asetaminofen merkaptat Sitokrom P450 Sitokrom P450 merkaptat Asetaminofen Kematian sel NAPKI Jika <30% glutation normal
Pengikatan kovalen asam amino pada protein dan enzim
6
diulang sebanyak 5 kali hingga warna ekstrak sama dengan warna pelarut awal. Ekstrak tersebut kemudian disaring dengan kertas saring. Filtrat dikumpulkan dan dirotavapor pada suhu 40ºC kondisi vakum hingga kering.
Uji Fitokimia (Harbone 1987)
Uji flavonoid dan Senyawa Fenolik.
Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah 2 mL etanol 30% sampai terendam lalu dipanaskan. Filtratnya dibagi 2, yang satu ditambah NaOH sebanyak 3 tetes 10% (b/v) dan filtrat satunya lagi ditambahkan H2SO4 sebanyak 3 tetes.
Terbentuknya warna merah karena penambahan NaOH menunjukkan adanya senyawa fenolik hidrokuinon, sedangkan warna merah yang terbentuk akibat penambahan H2SO4pekat menunjukkan adanya flavonoid.
Uji Alkaloid. Sebanyak 10 mL kloroform ditambah dengan ekstrak sampel 0.1 g dan beberapa tetes ammonia. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H2SO4 2 M. Fraksi asam diambil kemudian
ditambahkan dengan pereaksi Dragendorf 3 tetes, Meyer sebanyak 3 tetes, dan Wagner sebanyak 3 tetes. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan merah oleh pereaksi Dragendorf, endapan putih oleh pereaksi Meyer, dan endapan coklat oleh pereaksi Wagner.
Uji Tanin. Sebanyak 1 g serbuk bahan ditambah 10 mL akuades kemudian dididihkan selama 30 menit. Setelah dingin, campuran disaring dan filtratnya ditambah FeCl3 1%
sebanyak 5 mL (b/v). Warna biru tua atau hitam menunjukkan adanya tanin.
Uji Saponin. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah akuades 5 mL dan dipanaskan selama 5 menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok. Timbulnya busa selama ± 10 menit menunjukkan adanya saponin.
Uji Triperpenoid dan Steroid. Ekstrak sampel sebanyak 0.1 g ditambah 2 mL etanol 30% kemudian dipanaskan dan disaring. Selanjutnya filtrat diuapkan dan ditambahkan eter sebanyak 1 mL. Lapisan eter ditambah dengan pereaksi Lieberman Buchard (3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2S04pekat).
Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid.
Perlakuan Hewan Coba
Hewan coba yang digunakan tikus dengan galurSprague dawleyberbobot badan 170-250 g, jantan dan sehat. Hewan percobaan berjumlah 25 ekor dikelompokkan menjadi 5 kelompok dan masing-masing kelompok terdiri
atas 5 ekor. Tikus dikandangkan secara individu beralaskan sekam kayu. Bobot badan tikus dan pakan yang dikonsumsi oleh tikus ditimbang setiap hari. Tikus diberi pakan standar 20 g/ekor/hari dengan air minum secara
ad libitum selama tahap adaptasi dan perlakuan. Sebelum perlakuan, tikus diadaptasi selama 14 hari untuk menyeragamkan cara hidup dan pola makan dengan pakan standar, serta membiasakan diri dengan lingkungannya. Komposisi pakan standar yang digunakan terdapat pada Tabel 1.
Tabel 1 Komposisi pakan standar tikus Komposisi (%) Protein kasar 18 Lemak 6 Serat kasar 6 Kadar abu 8 Kalsium 0.8 Fosfor 1.05 Ekstrak-Nitrogen bebas 53
Tikus kelompok I merupakan kelompok normal (N) yang hanya diberi pakan standar selama penelitian dan dicekok akuades pada hari ke-0 hingga ke-21. Kelompok II adalah kelompok negatif (KN) yang dicekok parasetamol dosis 500 mg/kg BB pada hari ke- 0 hingga ke-21. Kelompok III adalah atau kontrol positif (KP) yang menggunakan Curliv®plus (obat hepatitis) dengan dosis 42.86 mg/kg BB dari hari ke-0 hingga hari ke-21. Kelompok IV adalah kelompok ekstrak dosis 200 mg/kg BB (ED200), dan kelompok V kelompok ekstrak dosis 300 mg/kg BB (ED300) dari hari ke-0 hingga hari ke-21. Kelompok II hingga V secara bersamaan dicekok parasetamol 500 mg/kg BB dari hari ke-8 hingga hari ke-14. Pengambilan darah pada kelima kelompok dilakukan sebanyak empat kali, yaitu pada hari ke-0,-7,-14 dan -21 untuk pengukuran kadar enzim ALT dan AST serum darah. Selanjutnya tikus dinekropsi. Darah tikus diambil dari pembuluh vena ekor (hari ke-0 dan ke-21). Gunting dan ujung ekor tikus disterilkan terlebih dahulu dengan alkohol 70%. Pemotongan dilakukan maksimal 5 mm dari ujung ekor dan ekor dibersihkan kembali dengan Betadine. Sampel darah yang diperoleh pada vial didiamkan pada kotak berisi es dan disimpan pada lemari pendingin selama semalam. Serum dipisahkan dengan sentrifugasi 3000 rpm pada suhu selama 15 menit.
7
Pengukuran AST dan ALT
Pengukuran ALT dan AST yang dilakukan menggunakan metodeInternational Federation of Clinical Chemistry (IFCC) tahun 1986. Pengukuran ALT dan AST menggunakan satuan unit yang berdasarkan jumlah enzim yang dapat mengubah 1 µmol substrat per menit yang bertujuan untuk melihat aktivitas ALT dan AST berdasarkan jumlah NADH yang digunakan. Reaksi yang terbentuk selama pengukuran aktivitas ALT terdiri atas dua reaksi, substrat yang digunakan adalah α- ketoglutarat yang bereaksi dengan L-alanin (enzim) dan dikatalisis oleh ALT pada serum membentuk glutamat dan piruvat. Setelah itu piruvat yang terbentuk bereaksi dengan NADH serta H+ dikatalisis oleh laktat dehidrogenase membentuk laktat dan NAD+. Pada pengukuran aktivitas AST juga terdapat 2 reaksi, substrat yang digunakan α-ketoglutarat yang kemudian bereaksi dengan L-aspartat menghasilkan glutamat dan oksaloasetat. Oksaloasetat yang terbentuk kemudian bereaksi dengan NADH serta H+ dikatalisis oleh laktat dehidrogenase membentuk malat dan NAD+
.
Masing-masing enzim baik AST dan ALT terdiri atas 2 reagen, yaitu reagen 1 (buffer) dan reagen 2 (substrat). Reagen 1 untuk pengukuran ALT terdiri atas Tris pH 7.8 80 mmol/L, L-alanin 500 mmol/L, dan NADH. Reagen 2 terdiri atas laktat dehidrogenase (LDH) 1200 U/L dan α-ketoglutarat 12 mmol/L. Reagen 1 untuk AST Tris pH 7.8 80 mmol/L, L-aspartat 200 mmol/L, dan NADH 0.18 mmol/L serta reagen 2 terdiri atas laktat dehidrogenase (LDH) 800 U/L, malat dehidrogenase (MDH) 600 U/L dan α- ketoglutarat 12 mmol/L. Persiapan reagen AST maupun ALT dilakukan dengan melarutkan 1 tablet reagen 2 (substrat) ke dalam 15 mL reagen 1(buffer). Larutan dihomogenkan didalam botol tertutup.
Serum darah sebanyak 50 μL dicampur dalam 500 μL reagen campuran (reagen 1 dan reagen 2) AST atau ALT. Pembacaan serapan dilakukan pada panjang gelombang 340 nm dengan spektrofotometer filter (filter fotometer) per menit selama 3 menit. Kadar enzim yang terukur langsung berupa satuan U/L. Persamaan penghitungan yang digunakan adalah:
Kadar AST/ALT = 1746 x ΔAbsorban/menit
Pembuatan Preparat Histopatologi Hati
Metode yang digunakan adalah metode Andrew Kent 1985 yang terdiri atas 4 tahap, yaitu fiksasi, dehidrasi, pencetakan
(embedding), dan pewarnaan (staining). Tahap fiksasi dilakukan dengan memotong organ hati dengan ukuran 2x2x1 cm, dimasukkkan ke dalambuffer neutral formalin10% (BNF 10%) selama 3x24 jam, kemudian dipotong lagi dengan ukuran lebih tipis. Potongan-potongan hati tersebut dilanjutkan ke tahap dehidrasi, yaitu dengan perendaman menggunakan etanol bertingkat (etanol 70%, 80%, 96%, absolut I, absolut 2). Kemudian etanol dihilangkan dengan xilol I, II, dan III masing-masing selama 40 menit. Infiltrasi menggunakan parafin cair dilakukan pada suhu 60 oC selama 4 kali masing-masing selama 30 menit. Sebelum pencetakan cetakan dicuci dengan campuran etanol 96%, xilol, dan air.
Pencetakan dilakukan dengan penuangan parafin panas dalam blok cetakan sebanyak setengah cetakan dengan alat Tissue Tec.
Potongan hati dimasukkan ke dalamnya secara perlahan agar tidak menyentuh dasar cetakan lalu ditutup lagi dengan parafin cair. Setelah beku organ dalam parafin tersebut dipotong dengan alat mikrotom setebal 4-5 μm. Potongan yang diperoleh dimasukkan ke dalam air hangat (40 oC) untuk melelehkan parafin, kemudian diletakkan dalam kaca objek. Potongan tadi dikeringkan dalam oven inkubator bersuhu 56oC selama satu malam.
Tahap pewarnaanHaematoxylin Eosin(HE) dilakukan setelah diparafinisasi, yaitu dengan merendamnya setelah xilol 2 kali masing- masing selama 2 menit, rehidrasi dengan etanol absolut selama 2 menit, kemudian dengan etanol 95% dan 80% masing-masing selama 1 menit, dan dicuci dengan air mengalir. Kemudian preparat direndam dalam pewarnaan
Mayer’s Haemotoxylin selama 8 menit, dicuci dengan air mengalir, dimasukkan ke dalam LiCl selama 30 detik, dan dicuci lagi dengan air mengalir. Kemudian irisan preparat diberi pewarna eosin selama 2-3 menit, lalu dicuci. Setelah itu, irisan hati dicelupkan dalam etanol 95% dan absolut I masing-masing sebanyak 10 kali dan diteruskan dengan etanol absolut II selama 2 menit, xilol 1 selama 1 menit dan xilol II selama 2 menit. Setelah diangin- anginkan beberapa saat, preparat yang telah diwarnai tersebut kemudian diberi mounting mediumdan ditutup dengan kaca penutup.
Pengamatan Histopatologi Hati
Kerusakan seperti nekrosis, degenerasi butir, degenerasi lemak, sirosis, dan pendarahan merupakan parameter pengamatan yang digunakan. Pemberian skornya adalah sebagai berikut:
8
1: kerusakan ≤ 25% dari daerah pandang 2: kerusakan 25-50% dari daerah pandang 3: kerusakan 50-70% dari daerah pandang 4: kerusakan 75-100% dari daerah pandang
Analisis Data
Data bobot badan diuji menggunakan uji-T.
Data konsentrasi AST dan ALT yang diperoleh kemudian dimasukkan dalam uji analysis of varian (ANOVA) pada tingkat kepercayaan 95% dan taraf α = 0.05 menggunakan perangkat lunak SPSSStatistical Data Analysis
seri 17. Model rancangan tersebut adalah: Yij= µ + λi+ εij.
Keterangan:
µ = Pengaruh rataan umum
λi = Pengaruh perlakuan ke-i, i = 1, 2, 3, 4
εij = Pengaruh galat perlakuan ke-i dan
ulangan ke-j, j = 1, 2, 3
i = 1 adalah perlakuan pemberian pakan standar dan cekok akuades
i = 2 adalah perlakuan pemberian pakan standar, akuades, dan parasetamol dosis 500 mg/kg
i = 3 adalah perlakuan pemberian pakan standar, akuades, parasetamol, dan Curliv ® dosis 42.86 mg/kg BB
i = 4 adalah perlakuan pemberian pakan standar, akuades, parasetamol, dan ekstrak daun kari dosis 200 mg/kg BB i = 5 adalah perlakuan pemberian pakan
standar, akuades, parasetamol, dan ekstrak daun kari dosis 300 mg/kg BB