BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikologi Tumbuhan jurusan Proteksi Tanaman IPB, rumah kaca Cikabayan IPB Bogor dan kebun percobaan Pusat Kajian Buah-buahan Tropik di daerah Tajur, Bogor. Penelitian berlangsung dari bulan April 2005 sampai Maret 2006.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu: bibit pisang Cavendish dan Barangan hasil kultur jaringan, plastik PVC (Polyvinyl Chloride), pupuk NPK, pupuk kandang, media PDA (Potato Dextrose Agar), media Komada, media Martin Agar, media SCA (Starch Casein Agar), media TSA (Triptic Soy Agar), media King’s B, media NB (Nutrient Broth), air steril dan lain- lain.

Alat-alat yang digunakan yaitu: jarum ose, pengaduk, erlenmeyer, penangas air, microwave, kapas, cawan petri, tabung reaksi, pelubang gabus, pipet, gelas ukur, timbangan, mikroskop, otoklaf, oven, kotak isolasi, alat tulis dan lain- lain.

Metode

Isolat Fusarium oxysporum f. sp. cubense

Patogen Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) yang digunakan adalah IPB 057 yang merupakan isolat koleksi dari Laboratorium Mikologi Tumbuhan jurusan Proteksi Tanaman IPB. Sedangkan untuk percobaan di lapang, digunakan lahan yang sudah terinfestasi secara alami oleh Foc.

Bakteri antagonis

Bakteri antagonis yang digunakan yaitu dari kelompok Bacillus sp., dan Pseudomonas fluorescens. Bacillus sp. ditumbuhkan dalam media TSA yang diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang, kemudian dimurnikan dan disimpan dalam media TSA cair pada suhu 4⁰C. Bakteri Pseudomonas fluorescens

12

ditumbuhkan dalam media King’s B dan diinkubasi 48 jam pada suhu ruang, kemudian dimurnikan dalam TSA cair dan disimpan suhu 4⁰C.

Perbanyakan bakteri antagonis

Perbanyakan bakteri antagonis dilakukan di Laboratorium Mikologi Tumbuhan Jurusan HPT, Fakultas Pertanian IPB. Satu petri bakteri pada media NB (Nutrient Broth) yang telah berumur 48 jam ditambahkan sebanyak 10 ml air steril, kemudian dilakukan pengocokan sehingga biakan tercampur dengan air steril tersebut sampai merata. Selanjutnya suspensi dimasukkan ke dalam 90 ml NB (Nutrient Broth), diinkubasi dan dikocok selama 48 jam.

Uji lapang

Persiapan media tumbuh. Tanah dicampur dengan bahan organik kotoran sapi yang telah matang (5:1 v/v) yang diberikan perlubang tanah.

Inokulasi patogen. Fusarium oxysporum f.sp. cubense yang digunakan berasal dari lahan yang telah terinfestasi layu fusarium. Diharapkan Foc yang berada di lahan yang akan ditanami pisang dapat menjadi sumber inokulum.

Solarisasi tanah. Solarisasi tanah dilakukan dengan menutup permukaan lahan menggunakan plastik PVC (Polyvinyl chloride) bening dengan ketebalan 0.05 mm. Sebelumnya tanah lahan diolah dan diairi secukupnya sampai semua lapisan tanah basah. Solarisasi dilakukan selama tiga minggu dan empat minggu. Untuk kontrol, lahan dibiarkan tanpa ditutup plastik PVC (Polyvinyl Chloride).

Perlakuan bibit pisang dengan bakteri antagonis. Perlakuan antagonis dilakukan pada saat akan menanam bibit pisang dengan cara mencelupkan akar tanaman pisang kedalam suspensi bakteri antagonis dengan kepadatan 10⁹/ml selama 24 jam kemudian dipindahkan ke lahan. Perlakuan bibit pisang dengan bakteri yaitu B1: P. fluorescens PG01 + B. polymixa BG25, B2: P. fluorescens ES32 + B. subtilis SB3 dan B0: tanpa perlakuan bakteri.

Rancangan percobaan dan macam perlakuan penelitian. Penelitian disusun menurut RAKL dengan dua faktor yaitu solarisasi (tanpa solarisasi [S0], solarisasi tiga minggu [S3] dan solarisasi empat minggu [S4]) dan perlakuan

13

bakteri ( tanpa bakteri [B0], PG01+BG25 [B1], dan ES32+SB3 [B2]). Masing-masing perlakuan diulang tiga kali. Banyaknya tanaman pisang tiap perlakuan adalah 4-6 tanaman.

Penanaman bibit dan pemeliharaan. Bibit pisang yang digunakan adalah kultivar Barangan umur 3 bulan yang telah diaklimatisasi dan merupakan hasil perbanyakan kultur jaringan yang diproduksi oleh BIOTROP Bogor. Setelah bibit dicelup dengan suspensi bakteri antagonis selama 24 jam, bibit ditanam ke lahan. Setelah penanaman, bibit tersebut dipupuk dengan NPK (15:15:15) sebanyak 10 gram perlubang tanam setiap bulan denga n cara menaburkan pupuk di sekeliling batang tanaman.

Percobaan pada Tanaman dalam Pot

Persiapan media tumbuh. Tanah dicampur dengan bahan organik kotoran kambing yang telah matang (5:1 v/v). Setiap pot (diameter 30 cm) diisi dengan media tumbuh sampai penuh dan rata dengan pinggiran atas pot.

Inokulasi patogen. Fusarium oxysporum f.sp. cubense yang digunakan adalah isolat IPB 057 koleksi Lab Mikologi Tumbuhan Institut Pertanian Bogor. Patogen yang digunakan adalah Foc ras 4 yang diperbanyak dalam medium PDB (Potato Dextrose Broth) dikocok selama 7 hari. Foc yang telah diperbanyak disaring dengan kertas Whatman no. 5, pelet yang tertinggal dihancurkan dengan blender dan disuspensikan ke dalam 200 ml air steril kemudian dicampur 1 kg tanah yang telah diserilisasi dengan uap panas (121⁰C, 121 lb, 30 menit) 2 kali, lalu diinkubasi selama 4 minggu untuk mendapatkan klamidospora. Kerapatan populasi klamidospora dihitung dengan metode pengenceran pada medium PDA yang ditambah asam laktat 20%. Tanah yang mengandung klamidospora disimpan dalam suhu ± 17⁰C dan digunakan sebagai sumber inokulum (Widodo 2000). Inokulasi patogen dilakukan dengan cara infestasi inokulum pada pot percobaan sebelum solarisasi dengan kerapatan inokulum 10³ cfu/g tanah.

Solarisasi tanah. Solarisasi tanah dilakukan dengan menutup permukaan pot menggunakan plastik PVC (Polyvinyl Chloride) bening dengan ketebalan 0.05 mm. Sebelumnya tanah dalam pot diairi secukupnya sampai semua lapisan tanah basah. Solarisasi dilakukan selama, dua minggu, tiga minggu dan empat

14

minggu. Sebagai kontrol pot dibiarkan tanpa ditutup plastik PVC (Polyvinyl Chloride).

Perlakuan bibit pisang dengan bakteri antagonis. Perlakuan antagonis dilakukan pada saat akan menanam bibit pisang dilakukan setelah solarisasi dengan cara mencelupkan akar tanaman pisang ke dalam suspensi bakteri antagonis selama 24 jam kemudian dipindahkan ke pot yang diberi perlakuan tanpa solarisasi, solarisasi dua minggu, tiga minggu dan empat minggu. Perlakuan pertama; B1 yaitu P. fluorescens PG01 + B. polymixa BG25; B2 yaitu P. fluorescens ES 32 + B. subtilis SB3; B12 yaitu P. fluorescens PG01 + B. polymixa BG25 + P. fluorescens ES 32 + B. subtilis SB3; B0 bibit pisang dicelupkan di air steril.

Rancangan percobaan dan macam perlakuan penelitian. Penelitian disusun menurut RAKL dengan dua faktor yaitu solarisasi (tanpa solarisasi [S0], solarisasi dua minggu (S2), solarisasi tiga minggu [S3] dan solarisasi empat minggu [S4]) dan perlakuan bakteri ( tanpa bakteri [B0], PG01+BG25 [B1], ES32+SB3 [B2], PG01+BG25+ ES32+SB3 [B12] ). Masing- masing perlakuan diulang tiga kali. Banyaknya tanaman pisang tiap perlakuan adalah 5 tanaman.

Penanaman bibit dan pemeliharaan. Bibit pisang yang digunakan adalah kultivar Cavendish yang telah diaklimatisasi selama 2 bulan dan merupakan hasil perbanyakan kultur jaringan. Setelah bibit dicelup dengan suspensi bakteri antagonis, bib it ditanam ke dalam pot. Setelah penanaman, bibit tersebut dipupuk dengan NPK (15:15:15) sebanyak 1 gram per lubang tanam setiap bulan dengan cara menaburkan pupuk disekeliling batang tanaman.

Peubah yang Diamati

Periode Inkubasi

Periode inkubasi dihitung dari mulai penanaman sampai munculnya gejala awal yang ditandai dengan terjadinya penguningan daun. Gejala awal nampak pada daun pertama atau daun kedua. Gejala ini biasanya terlihat dari tepi daun menuju ke pangkal atau pelepah daun.

15

Kejadian Penyakit (disease incidence=DI)

Tingkat kejadian penyakit dihitung dengan cara mengamati gejala eksternal pada tanaman. Perhitungan dilakukan tiap bulan mulai dari penampakan gejala pertama sampai 120 hari setelah tanam (rumah kaca). Tingkat kejadian penyakit dihitung dengan rumus yang dikemukakan Campbell (1990) menggunakan rumus:

DI = n/N X 100%

DI : Disease incidence (% gejala layu) n : Jumlah tanaman terserang

N : Jumlah tanaman yang diamati

Keparahan Penyakit (Disease Severity=DS)

Pengukuran kerusakan jaringan pembuluh pada bonggol kultivar pisang dilakukan dengan memotong bonggol tanaman secara horizontal pada bagian tengah bonggol dan dilihat keparahan gejala dengan membuat skoring. Keparahan penyakit dapat dihitung dengan rumus yang dikemukakan Campbell (1990) yaitu;

DS = ∑(ni X vi) / Z X N x 100% DS : Disease severity (%)

ni : Jumlah bonggol yang terserang dengan kategori ke i vi : Nilai numerik ke i

Z : Nilai numerik kategori serangan tertinggi N : Jumlah bonggol yang diamati

Skoring dilakukan dengan metode Cordiero (1994) yang dimodifikasi dengan cara memotong bagian bonggol mulai dari jarak 1 cm, 2 cm, 3 cm, 4 cm, 5 cm, dan 6 cm dari pangkal bonggol secara horizontal, kemudian nilai skoring ditentukan sebagai berikut :

1 = Tidak ada diskolorisasi pada berkas pembuluh 2 = Ada sedikit diskolorisasi

3 = Diskolorisasi ≤ 1/3 berkas pembuluh 4 = Diskolorisasi > 1/3 – 2/3

5 = Diskolorisasi lebih dari 2/3

16

Modifikasi skoring dilakukan seperti yang terlihat pada diagram (Gambar 1).

Gambar 1. Skoring Cordiero (modifikasi)

Analisis Mikrob

Analisis populasi mikrob dilakukan pada awal dan akhir percobaan dari sampel komposit tanah dengan metode pengenceran berseri (serial dilution method). Sepuluh gram sampel tanah dicampur dengan 90 ml air steril, dikocok 30 menit dengan pengocok putar pada kecepatan 150 rpm, kemudian diambil 1 ml dan dicampurkan kedalam 9 ml air steril begitu seterusnya sampai pengenceran 10^-8.

Penghitungan populasi mikrob dilakukan dengan cara menuangkan 0.1 ml pengenceran 10^-2 untuk populasi Fusarium, 10^-3 untuk cendawan tanah lainnya, 10^-5 untuk aktinomisetes dan 10^-8 untuk populasi bakteri ke dalam cawan petri berisi media tumbuh. Media ya ng digunakan adalah media PCNB (Pentachloronitrobenzene), Martin Agar, SCA (Starch Casein Agar), dan TSA (Triptic Soy Agar) kekuatan 0.1, masing- masing untuk Fusarium, cendawan tanah, aktinomisetes, dan bakteri. Semua cawan tersebut diinkubasi pada suhu ruang dan dilakukan pengamatan dengan penghitungan jumlah koloni (colony forming unit) dan dikalikan dengan tingkat pengenceran sehingga diketahui populasi per gram tanah.

4

5

2

3

1

6

VI x 1 VI x 3 VI x 2 VI x 5 VI x 4 VI x 6 Bonggol Pisang

17

Uji Perkecambahan Konidia dan Pembentukan Klamidospora Foc Uji perkecambahan konidia dan pembentukan klamidospora dilakukan untuk menentukan keberadaan mikrob pada tanah yang menekan patogen. Foc dibiakkan pada media potato dex trose agar (PDA). Setelah 7 hari inkubasi, konidia Foc diambil kemudian dinkubasi awal selama 1 jam pada suhu 24⁰C pada larutan yang berisi 0.5% L-asparagin dan 0.5% glukosa. Kemudian disiapkan komposit tanah contoh dari percobaan rumah kaca. Sebanyak 10 g tanah ditambah 90 ml air dicampur. Kemudian dilakukan langkah- langkah berikut : 1. Perlakuan pertama, larutan disaring dengan kertas Whatman no. 5, suspensi

yang dihasilkan, digunakan sebagai tempat uji perkecambahan konidia dan pembentukan klamidospora. Dengan cara mengambil suspensi Foc yang dicampur suspensi tanah (1:1 v/v), lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 24⁰C dan diamati persentase perkecambahan konidianya. Untuk mengamati tingkatan pembentukan klamidospora, biarkan campuran tersebut selama 7 hari, kemudian teteskan larutan 1 % rose bengal, dan diamati persentase pembentukan klamidosporanya.

2. Perlakuan kedua, larutan disaring dengan saringan millipore 0.22 µm. Kemudian suspensi yang dihasilkan digunakan sebagai tempat uji perkecambahan konidia dan perkembangan klamidospora seperti langkah pertama.

3. Perlakuan ketiga, larutan disaring dengan kertas Whatman no. 5, suspensi yang dihasilkan diotoklaf. Kemudian dilakukan seperti langkah pertama.

Analisis Data

Untuk menguji pengaruh perlakuan terhadap peubah yang diamati dilakukan analisis ragam dengan menggunakan Statistix 8.0 (Copyright 1985-2003 Analytical Software) program. Khusus untuk tingkat kejadian penyakit data yang dianalisis adalah data transformasi vy+0.5. Selanjutnya tiap perlakuan yang berpengaruh nyata dilakukan uji Tukey’s untuk melihat perbedaan tiap perlakuan pada taraf 5%.

18