Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Balai Penelitian Veteriner Bogor. Waktu penelitian dilakukan pada bulan Agustus 2005 sampai dengan Pebruari 2006.
Materi Penelitian
Materi penelitian terdiri dari 104 (seratus empat) butir telur ayam ras yang diambil dari 67 orang pedagang telur ayam ras di 16 (enam belas) pasar tradisional di Kabupaten Tangerang. Pengambilan sampel dilakukan selama 2 minggu berturut-turut dengan menggunakan plastik steril dan dibawa ke laboratorium pada suhu ruangan. Sampel selanjutnya dibawa ke Laboratorium Bakteriologi, Balai Penelitian Veteriner Bogor untuk dilakukan pengujian kuman S. Enteritidis.
Sampling ditentukan dengan menggunakan metode proporsional random sampling, sedangkan untuk menghitung besaran sampel menggunakan rumus: 4 PQ
n =
L2 Keterangan:
n = besaran sampel yang digunakan P = asumsi prevalensi
Q = (1 - P)
L = galat yang diinginkan (Martin et al. 1988 & Thrusfield 1994).
Dengan tingkat konfidensi 95% dan galat yang diinginkan 5% serta asumsi prevalensinya 7% maka didapat:
4 x 0,07 x 0,93 n =
(0,05)2 = 104 sampel telur
Jumlah sampel telur ayam ras yang diambil dari tiap pedagang di setiap pasar tradisional dapat dilihat pada lampiran tesis ini.
Bahan dan Alat-Alat Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan berupa Buffered Pepton water, Rappaport Vassiliadis Broth, Xylose Lysine Deoxycholate, Manitol Selenite Cystein Broth, Mac Conkey Agar, Brilliant Green Agar, Triple Sugar Iron Agar, Lysine Iron Agar, Urea Agar, Nutrient Agar, Nutrient Broth, Pereaksi Indol, kapas, pewarnaan gram, NaCl fisiologis, alkohol 70%, isolat Salmonella sp. dalam Nutrient Agar miring, antisera (O dan H).
Alat-alat yang dipakai dalam penelitian ini yaitu petridish diameter 9 cm dan 12 cm, pipet 1 ml, erlenmeyer, beaker glass, tabung reaksi, cabinet UV, pengaduk, ose, mikropipet, vortex, bunsen, incubator, autoclave, microwaveoven, spreader, kaca preparat 5 x 7,5 cm, batang pengadukaglutinasi,lampu penerang, lemari es, freezer, bunsen, stomacher, pipet pasteur 1-10 ml, tabung reaksi 5 – 20 ml, timbangan 0,5 – 500 gram, mikroskop, rubber teat, tabung craigie, rak tabung reaksi.
Metode
Isolasi dan Identifikasi Salmonella Enteritidis a. Kerabang Telur
Setiap sampel kerabang telur yang memiliki berat berkisar 15 – 20 gram dimasukkan ke dalam 135 - 180 ml (10%) larutan Buffered Pepton Water (BPW) sebagai media pre-enrichment, dihomogenisasi dan diinkubasi pada suhu 35- 37 oC selama 16-20 jam. Campuran sampel kerabang, putih dan kuning telur dalam BPW dapat dilihat pada gambar 6 berikut ini :
Gambar 6 Penimbangan kerabang telur serta pemberian media pre-enrichment Buffered Pepton Water (BPW) pada kerabang, kuning dan putih telur
23
Sebanyak 1 ml suspensi tersebut ditanam pada 9 ml (10%) media enrichment Rappaport Vassiliadis Broth (RVB) dan diinkubasi pada suhu 42 oC selama 24 jam. Suspensi tersebut diambil satu ose dan ditanam pada media agar selektif Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) dan diinkubasi lagi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Sebanyak 3-5 koloni berwarna hitam yang diduga Salmonella sp. kemudian dilakukan uji biokimia dengan melakukan inokulasi pada media TSIA, LIA, Indol, Sitrat dan Urea. Koloni yang diduga Salmonella sp. pada media XLD dapat dilihat pada gambar 7 berikut ini :
Gambar 7 Morfologi biakan Salmonella sp. pada media Xylose Lysine Deoxycholate (XLD)
Biakan yang ditumbuhkan pada media penyubur dan media selektif, dinyatakan Salmonella sp.apabila memberikan hasil uji TSIA positif yang ditunjukan dengan warna slant merah dan butt kuning; LIA positif yang ditunjukan dengan warna media slant hitam dan butt violet; H2S positif yang ditunjukan dengan warna hitam pada media TSIA dan LIA; Indol negatif yang ditunjukan dengan tidak terbentuknya cincin berwarna pink; Sitrat positif yang ditunjukan dengan adanya pertumbuhan dan warna biru pada media serta Urea negatif dimana tidak terjadi perubahan warna media. Koloni bakteri yang diduga presumtif Salmonella sp., ditanam pada media nutrient agar miring dan semisolid untuk dilanjutkan dengan Serotiping untuk menentukan serotipenya (Balitvet 2005).
Morfologi biakan Salmonella
Negatif pada media XLD
Morfologi biakan yang diduga
Jenis Uji Hasil Uji Gambar TSIA H2S LIA Sitrat Positif Positif Positif Positif Indol Negatif Negatif Positif Urea Negatif Negatif Positif
Gambar 8 Hasil uji biokimia pada isolat persumtif Salmonella sp. b. Putih dan Kuning Telur
Sampel putih dan kuning telur diambil dengan memecah telur terlebih dahulu. Kemudian dipisahkan antara putih dan kuning telur. Langkah selanjutnya dari masing-masing bagian telur tersebut diambil 15 - 20 gram dan dimasukkan ke dalam 135 – 180 ml (10%) larutan Buffered Pepton Water (BPW) sebagai media preenrichmnet dan dihomogenisasi.
Selanjutnya pemeriksaan diteruskan seperti pada pengujian kerabang telur (Balitvet 2005). Pemisahan putih dan kuning telur serta pencampuran dalam BPW dapat dilihat pada gambar 9 berikut ini.
25
Gambar 9 Pemisahan putih dan kuning telur serta pemberian media pre-enrichment (BPW)
Serotiping Salmonella Enteritidis
Prinsip kerja serotiping untuk identifikasi antigen somatik O tahan panas, dilakukan dengan cara suspensi sel bakteri Salmonella sp. yang dipanaskan pada suhu 100 oC selama satu jam. Setelah dingin direaksikan dengan antiserum grup B, C, D dan E. Bila terjadi aglutinasi pada grup tertentu kemudian diuraikan menggunakan antiserum somatik (nomor antigen dalam grup tertentu). Sedangkan untuk identifikasi H antigen dari Salmonella yang sudah diketahui O serotipenya, dilakukan dengan mengkultur bakteri Salmonella tersebut pada media semisolid dengan tabung ”Craigie”. Bakteri yang mempunyai antigen flagella akan bergerak keluar dari dalam tabung ”Craigie” melalui dasar tabung, sedangkan yang tidak mempunyai flagella tidak terdapat pertumbuhan diluar tabung ”Craigie”. Satu suspensi sel bakteri hidup dibuat dari sel diluar tabung ”Craigie”, direaksikan dengan anti H antiserum antibodi spesifik poly Ha, Hb, Hc, Hd, He, dan H polyz. Kemudian dari grup poly H positif diuraikan menjadi nomor-nomor antigen H kelompok tersebut. Sampel dinyatakan positif S. Enteritidisbila berasal dari grup D, identifikasi O: 1, 9, 12, dan H: g, m, 1, 7, sesuai dengan Skema Kauffmann- White pada tabel 2 (Balitvet 2005).
Tabel 2 Struktur antigenik Salmonella menurut Skema Kauffmann-White Tipe Species/Serotipe Antigen O
(somatik) Antigen H (Flagella) Fase 1 Fase 2 A S. paratyphi A 1, 2, 12 8 - B S. paratyphi B 1, 4, (5), 12 B 1, 2 S. (schottmulleri) S. java 1, 4, (5), 12 B (1, 2) S. saint-paul 1, 4, (5), 12 e, h 1, 2 S. san-diego 4, (5), 12 e, h e, n, z15 S. derby 1, 4, (5), 12 f, g (1, 2) S. agona 1, 4, 12 f, g, s - S. typhimurium 1, 4, (5), 12 I 1,2 S. typhimurium var copenhagen 1, 4, 12 I 1, 2 S. heidelberg 1, 4, (5), 12 R 1, 2 S. tinda 1, 4, 12, 27 A e, n, z15 C1 S. paratyphi C 6, 7, (Vi) C 1, 5 S. choleraesuis 6, 7 (c) 1, 5 S. montevideo 6, 7 g, m, s, (p) - S. oranienburg 6, 7 m, t - S. thompson 6, 7 K 1, 5 S. infantis 6, 7 R 1, 5 C2 S. newport 6, 8 e, h 1, 2 D1 S. typhi 9, 12, (Vi) B - S. Enteritidis 1, 9, 12 g, m - S. dublin 1, 9, 12, (Vi) g, p - S. panama 1, 9, 12 l, v 1, 5 S. javiana 1, 9, 12 l, z28 1, 5 S. pullorum 1, 9, 12 - - S. sendai 1, 9, 12 A 1, 5 E1 S. oxford 3, 10 A 1, 7 S. anatum 3, 10 e, h 1, 6 S. london 3, 10 l, v 1, 6 S. meleagridis 3, 10 e, h l, w S. lexington 3, 10 z10 1, 5 E4 S. seftenberg 1, 3, 19 g, (s), t - F S. rubislaw 11 R e, n, x G2 S. worthington 1, 3, 23 Z l, w (Kauffmann 1972)
27
a. Menentukan Struktur Antigen ”O”
1. Penentuan antigen O atau somatik dilakukan dengan menggunakan antisera polivalen atau monovalen grup B, C, D, E karena grup ini yang paling sering ditemukan pada hewan;
2. Apabila salah satu grup dari antisera positif, maka untuk selanjutnya dilakukan uji dengan single faktor antisera yang sesuai sebagai berikut :
Grup B, menggunakan single factor 4,5,12,27 (4,5 adalah antigenik spesifik grup B)
Grup C, menggunakan single factor : 6,7; 6,8; 14; 8(20); 6,14
Grup D, menggunakan serum tunggal faktor (single factor) 12,46. Grup D mempunyai faktor spesifik 9. Antigen somatik 9 merupakan diagnostik faktor untuk grup D dan faktor ini dapat berkombinasi baik dengan faktor 12 dan 46. Grup E, menggunakan serum faktor tunggal 10,15,19. Bila terjadi aglutinasi dengan faktor 15, kemudian diuji dengan faktor 34 dan selanjutnya disesuaikan dengan skema Kauffmann-White.
b. Menentukan Serotipe yang Berhubungan dengan antigen ”H”
Suspensi bakteri Salmonella sp. yang dipakai adalah sama dengan suspensi bakteri untuk uji antigen O tersebut di atas, kemudian diuji terhadap antisera polivalen ”H”: Ha, Hb,Hc,He, g kompleks dan Poly z. Bakteri ini ditumbuhkan pada media semisolid dengan tabung Craigie dan diinokulasikan melalui tabung tersebut yang kemudian diinkubasikan pada suhu 37 oC selama 24 jam. Suspensi bakteri yang akan digunakan untuk uji antigen H diambil dari luar tabung Craigie pada permukaan semisolid. Apabila terjadi reaksi dengan dengan salah satu antisera tersebut diatas, kemudian diuji dengan salah satu antisera sebagai berikut : Ha : a, b, c, d, I Hb : K, lu/lw, r, y, z Hc : 2, 5, 6 , 7 He : h, x, Z15 Hg : ge, f, m, s, t, p, g, u Poly z : z6, z10, z4, z23, z29, z38
Bila tidak terjadi aglutinasi dengan antisera (H) tersebut di atas, dibuat preparat ”hanging drop” untuk mengetahui motiliti dari bakteri yang sedang diuji atau dengan metode ”Craigie”. Bila bakteri tersebut motil, biakan bakteri ini ditumbuhkan pada media diferensiasi (misalnya XLD, BRG), lalu diambil koloni tunggal untuk dilakukan uji biokimia lengkap agar diketahui apakah bakteri ini benar-benar Salmonella sp. atau bukan. Jika benar, maka dilakukan uji ulang Salmonella sp. untuk menentukan serotipenya. Setelah penentuan/uji terhadap antigen O dan H selesai, hasil ditabulasikan dan dicocokkan struktur antigen yang diperoleh dengan skema Kauffmann-White untuk mendapatkan nama serotipe Salmonella sp. yang diuji.
Analisis Data