BAB III. METODE PENELITIAN
3.4. Cara Kerja
Penelitian ini dilakukan persiapan pertumbuhan koloni di media F0, persiapan penanaman miselium di media F1.
3.4.1. Persiapan Pertumbuhan di Media F0 3.4.1.1. Pembuatan Media PDA
Pembuatan medium PDA dilakukan dengan cara 13 g bubuk PDA dilarutkan dengan akuades 333 mL. Selanjutnya media PDA dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer di atas hot plate. Lalu disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 1210C dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. Kemudian media yang telah steril didinginkan hingga mencapai suhu 45-500C dan dituang ke cawan Petri steril.
3.4.1.2. Pembuatan Media PDA + Whey Keju/Tahu
Pembuatan medium PDA+ whey keju/tahu dilakukan dengan cara persiapan whey keju dan whey tahu. Sebanyak 120 ml whey keju dilakukan pemanasan 85-950C selama 15 menit dan dibiarkan di suhu ruang selama 24 jam. Proses ini dilakukan sebanyak 3x (Sakinah, 2018). Hari ke 3 sebelum dilakukan pemanasan, whey keju dan whey tahu terlebih dahulu diatur pH dengan penambahan NaOH hingga mencapai pH 6 dan ditambahkan 1,8 g agar. Lalu, whey dihomogen kembali dengan magnetic stirrer.
Sebanyak 9,36 g bubuk PDA dilarutkan dengan akuades 120 mL. Selanjutnya media PDA dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer di atas hot plate. Lalu disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 1210C dengan tekanan 1,5 atm selama 15 menit. Media PDA dan whey keju/tahu dimasukkan dan dicampur ke Erlenmeyer dengan konsentrasi yang tercantum pada tabel 1.
Tabel 1. Komposisi pembuatan media F0 whey keju dan whey tahu
Kemudian media yang telah steril didinginkan hingga mencapai suhu 45-500C.
lalu media dituang ke cawan Petri steril.
3.4.1.3. Inokulasi Eksplan Jamur Kuping
Jamur kuping dipotong di dekat ujung atas tangkai, dan diletakkan di selembar kertas bersih. Jamur dibiarkan di atas kertas selama 10 menit. Cetakan spora pertama dibuang karena kemungkinan terdapat bakteri dan mikroorganisme lain. Selanjutnya jamur diletakkan di atas selembar kertas bersih dan tutupi dengan gelas kimia bersih untuk menghilangkan arus udara. Spora akan ditumpahkan di atas kertas steril selama 20 hingga 30 menit. Cetakan spora siap digunakan untuk inokulasi (Chang & Miles, 2004). Spora jamur kuping diletakkan di cawan berisi media PDA. Media PDA diinkubasi di suhu 25-280C selama 4 sampai 5 hari. Miselium yang terbentuk di atas PDA dipotong dengan diameter 5 mm menggunakan pisau yang sudah disterilkan.
Potongan jamur kuping tersebut dimasukkan ke media PDA, media PDA + whey tahu, media PDA + whey keju. Cawan Petri yang sudah dimasukkan eksplan lalu diinkubasi di inkubator (25-280C dan pH 6) selama 7 hari (Mayangsari et al., 2015).
Media Komposisi
PK1 PDA 80% (48 mL) + whey keju 20% (12 mL) PK2 PDA 60% (36 mL)+ whey keju 40% (24 mL) PK3 PDA 40% (24 mL) + whey keju 60% (36 mL) PK4 PDA 20% (12 mL) + whey keju 80% (48 mL) PT1 PDA 80% (48 mL) + whey tahu 20% (12 mL) PT2 PDA 60% (36 mL)+ whey tahu 40% (24 mL) PT3 PDA 40% (24 mL) + whey tahu 60% (36 mL) PT4 PDA 20% (12 mL) + whey tahu 80% (48 mL)
15
3.4.1.4. Pengamatan Koloni Jamur Pada Media F0
Data diameter koloni merupakan hasil rerata pengukuran diameter koloni berdasarkan (Handiyanto, Hastuti, & Prabaningtyas, 2013). Pengukuran kecepatan pertumbuhan koloni jamur (mm/hari) dilakukan menggunakan rumus kecepatan tumbuhan. Teknik pengumpulan data dengan diukur rata-rata diameter koloni jamur kuping pada masing-masing perlakuan setiap hari dari hari ke 4 dan 7 setelah inokulasi.
Rumus untuk menghitung kecepatan pertumbuhan (v) menurut Lilly dan Barnet (1951); Chang & Miles (2004) sebagai berikut.
Kecepatan pertumbuhan (v)
=diameter koloni akhir (7 hari)-diameter koloni awal (4 hari) rentang hari pengukuran
3.4.2. Persiapan Penanaman Miselium di Media F1 3.4.2.1 Pembuatan Media Kontrol
Metode yang digunakan untuk persiapan penanaman di media F1 berdasarkan penelitian Djuariah (2016), Maulidina et al. (2015) dan Sugiyanto (2016). Jagung digunakan sebagai media F1. 3 kg jagung dicuci dengan air yang mengalir. Jagung direndam selama kurang lebih 3-4 jam (Syafitri, 2019a). Jagung dikukus selama 30-40 menit kemudian didinginkan. Kemudian dikemas menggunakan botol kaca kapasitas 75-100 g/botol kaca yang sudah disterilkan sebelumnya. Jagung dimasukkan ke botol dengan mengisinya setinggi 11 cm dari 19 cm tinggi botol. Botol ditutup dengan kapas steril dan kertas steril. Botol disterilisasi di dalam panci kukusan 85-90oC selama 8 jam (Djuariah, 2016).
Alat, bahan dan ruang tempat memindahkan bibit disterilkan dengan menyemprotkan alcohol 70% dan sinar UV. Bibit F0 berupa miselium dalam cawan dipotong 1 cm2 dengan pisau steril dan ditanam ke jagung dengan pinset steril di dalam Laminar airflow cabinet. Kemudian media diinkubasi suhu 25-280C dengan
kelembapan 60-70% sampai miselium jamur tumbuh 100% memenuhi media F1 dan miselium menebal/siap digunakan. Pengamatan dilakukan dengan menghitung pertumbuhan miselium pada minggu 1 dan minggu 2. Pertumbuhan miselium ditentukan dengan mengukur miselium dari media dekat bibir botol sampai miselium yang memenuhi media (Syafitri, 2019b).
3.4.2.2 Pembuatan Media F1 dengan Penambahan Whey Keju/ Whey Tahu Metode yang digunakan untuk persiapan penanaman di media F1 berdasarkan penelitian Djuariah (2016), Maulidina et al. (2015) dan Sugiyanto (2016). Sebanyak 3 kg jagung dicuci dengan air yang mengalir. Jagung direndam suplemen (whey keju / whey tahu) dan diaduk sampai seluruh permukaan jagung terlapisi suplemen. Jagung direndam selama kurang lebih 3-4 jam (Syafitri, 2019a). Lalu, jagung dikukus selama 30-40 menit kemudian didinginkan. Selanjutnya siapkan 3 kg jagung yang dicuci dengan air yang mengalir. Jagung dikukus selama 30-40 menit lalu didinginkan.
Jagung dan whey keju/tahu dicampur ke dalam botol kaca kapasitas 75-100 g/botol kaca dengan komposisi campuran seperti pada tabel 2. Kemudian, botol ditutup dengan kapas steril dan kertas steril. Botol disterilisasi di dalam panci kukusan 85-90oC selama 8 jam (Djuariah, 2016).
Tabel 2. Komposisi pembuatan media F1 whey keju dan whey tahu Media Komposisi
PK1 Jagung 80% (80 g) + jagung whey keju 20% (20 g) PK2 Jagung 60% (60 g )+ jagung whey keju 40% (40 g) PK3 Jagung 40% (40 g) + jagung whey keju 60% (60 g) PK4 Jagung 20% (20 g) + jagung whey keju 80% (80 g) PT1 Jagung 80% (80 g) + jagung whey tahu 20% (20 g) PT2 Jagung 60% (60 g )+ jagung whey tahu 40% (40 g) PT3 Jagung 40% (40 g) + jagung whey tahu 60% (60 g) PT4 Jagung 20% (20 g) + jagung whey keju 80% (80 g)
17
Alat, bahan dan ruang tempat memindahkan bibit disterilkan dengan menyemprotkan alcohol 70% dan sinar UV. Bibit F0 berupa miselium dalam cawan dipotong 1 cm2 dengan pisau steril dan ditanam ke media jagung dengan pinset steril di dalam Laminar airflow cabinet. Kemudian diinkubasi suhu 25-280C dengan kelembapan 60-70% pada sampai miselium jamur tumbuh 100% memenuhi media F1 dan miselium menebal/siap digunakan. Pengamatan dilakukan dengan menghitung pertumbuhan miselium pada minggu 1 dan minggu 2. Pertumbuhan miselium ditentukan dengan mengukur miselium dari media dekat bibir botol sampai miselium yang memenuhi media (Syafitri, 2019b)
3.4.3. Analisis Kadar Proksimat Pada Whey
Analisis kadar proksimat dilakukan untuk mengetahui kadar protein kasar, kadar lemak dan kadar karbohidrat pada whey keju dan tahu. Analisis kadar proximat (Protein dan lemak) menggunakan metode yang bersumber dari SNI 01-2891-1992 (1992). Analisis kadar karbohidrat menggunakan metode yang bersumber dari Chemists (1990).
3.4.3.1. Analisis Kadar Protein Kasar
Kadar protein kasar pada whey diukur dengan metode kjeldahl. Metode kjeldahl terdiri dari tiga tahap yaitu destruksi, distilasi dan titrasi. Sampel yang telah dihaluskan ditimbang 1 g. Lalu, sampel dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 200 ml (dapat juga menggunakan tabung reaksi). Larutan ditambahkan dengan 1 g CuSO4 dan ditambah dengan 2,5 mL H2SO4 pekat. Selanjutnya, cuplikan didestruksi selama 2 jam pada suhu 1000C. Setelah hasil destruksi didinginkan. Kemudian, hasil destruksi dimasukkan ke dalam labu bulat yang telah diberi batu didih, 50 mL akua DM (demineralisasi) dan 15 mL NaOH 50 % w/v. Selanjutnya, larutan dilakukan distilasi. Distilat ditampung dalam erlenmeyer yang berisi 10 mL HCL 0,02N; 4 tetes metil merah dan 4 tetes metilen biru hingga volume total mencapai 40 mL. Kemudian, larutan dalam erlenmeyer dititrasi dengan larutan NaOH yang telah distandarisasi dengan larutan H2C2O4 0,02 N. Titik akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna dari ungu menjadi hijau. Volume NaOH
yang digunakan untuk titrasi dicatat. Replikasi untuk masing-masing cuplikan sebanyak lima kali. Perhitungan kadar protein total diperoleh dengan rumus:
Kadar protein kasar(%)
=
(NaOH untuk penitar blanko(mL)-NaOH untuk titar sampel(mL )x konsentrasi NaOH x 14,008 x 0,65
bobot sampel (g) x 100%
3.4.3.2. Analisis Kadar Lemak Total
Kadar lemak total pada whey diukur dengan metode soxhletasi. 2 g sampel ditimbang, lalu dimasukkan ke dalam kertas saring yang dialasi kapas. Kertas saring yang berisi sampel disumbat dengan kapas, selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu tidak lebih dari 80º C selama ± 1 jam. Kertas berisi sampel dimasukkan ke dalam alat Soxhlet yang sudah dihubungkan dengan labu lemak berisi batu didih yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya. Setelah itu, diekstrak dengan pelarut petroleum eter selama lebih kurang 6 jam. Petroleum eter disulingkan dan ekstrak lemak dikeringkan dalam oven pada suhu 105ºC. Lalu didinginkan dan ditimbang hingga bobot tetap. Perhitungan kadar lemak total diperoleh dengan rumus:
Kadar lemak total (%)
=bobot labu lemak sesudah ekstraksi(g)-bobot labu lemak sebelum ekstraksi(g)
bobot sampel(g) x 100%
3.4.3.3. Analisis Kadar Karbohidrat
Penetapan kadar karbohidrat dalam bentuk pati dilakukan berdasarkan metode titrimetri. Sebanyak 2 g bahan dimasukkan kedalam erlenmeyer, lalu ditambahkan akuades sampai volume 50 mL. Kemudian disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Suspensi disaring dengan kain saring, dan endapannya dicuci dengan akuades sampai diperoleh filtrat sebanyak 250 ml. Endapan dipindahkan secara kuantitatif dari kain saring kedalam erlenmeyer 500 ml dengan pencucian menggunakan 200 ml akuades kemudian ditambahkan HCl 25% sebanyak 20 ml,
19
dihidrolisis dibawah pendingin balik selama 1,5 jam dan didinginkan. Selanjutnya dinetralkan dengan NaOH 45% dan dilakukan pengenceran sampai volumenya 500 ml.
Lalu disaring dengan kain saring.
Sebelum penentuan kadar pati sampel, terlebih dahulu dibuat kurva standar dengan membuat larutan glukosa standar (10 mg glukosa anhidrat/100 ml air), dari larutan glukosa standar tersebut dilakukan 6 kali pengenceran sehingga diperoleh larutan glukosa dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, dan 10 mg/ml. Sebanyak 7 buah tabung reaksi bersih, masing-masing diisi dengan 1 ml larutan glukosa standar tersebut di atas.
Satu tabung diisi akuades sebagai blanko. Kemudian dalam tabung reaksi ditambahakan fenol 5% sebanyak 1 ml. Panaskan dengan penangas air pada suhu 30oC selama 20 menit. Kurva standar glukosa dengan OD (Optical Density). Optical density masing-masing larutan tersebut dibaca pada panjang gelombang 490 nm. Penentuan kadar pati sampel dilakukan seperti cara penentuan kurva standar glukosa. Jumlah kadar pati ditentukan berdasarkan OD larutan contoh dan kurva standar dapat dihitung berdasarkan rumus berikut:
kadar pati (%)=
Glukosa yang diperoleh dari kurva standar x Volume sampel (ml) x Faktor pengenceran sampel x 0,9
bobot sampel (g) x 100%