DAFTAR PUSTAKA

DAN PENETRASI DUA ISOLAT Cronobacter sakazakii

DAFTAR PUSTAKA

 

2010), dapat berpenetrasi pada akar tanaman tomat (Schmid et al. 2009), dan menjadi penyebab busuk kuning pada bagian dalam pepaya (Keith et al. 2008). Kemampuan penetrasi ke dalam bagian tanaman melalui rongga juga ditunjukkan oleh bakteri lainnya yaitu Pseudomonas yang berpenetrasi ke bagian dalam daun melalui stomata (Spinelli et al. 2010).

Dengan demikian faktor yang berkontribusi terhadap adanya cemaran C. sakazakii pada produk jagung kering adalah suhu pengeringan yang rendah, jumlah kontaminan awal yang tinggi dan kadar air akhir jagung yang masih tinggi. Kemampuan C. sakazakii berkolonisasi pada permukaan bahan pangan dan memasuki bahan pangan melalui luka atau rongga juga menjadi faktor pendukung terjadinya kontaminasi.

KESIMPULAN

Isolat mutan C. sakazakii YRt2a dan FWHd16 berlabel Green Fluorescent Protein dapat diaplikasikan untuk mempelajari ketahanan panas, kemampuan kolonisasi dan penetrasi bakteri tersebut selama pengeringan. Kedua isolat mengalami penurunan jumlah selama pengeringan jagung pada suhu 40^oC, 45^oC dan 50^oC dan masih terdapat koloni sebelum kadar air jagung mencapai 14%. Suhu pengeringan 40oC tidak efektif untuk mereduksi jumlah C. sakazakii. Isolat toksik FWHd16 lebih tahan pada ke-3 suhu pengeringan dibandingkan dengan isolat nontoksik YRt2a dengan laju penurunan untuk masing-masing suhu adalah 0.7, 0,9 dan 1,1 siklus log/hari. Kedua isolat mampu berkolonisasi di permukaan jagung dan berpenetrasi ke dalam jagung melalui bagian yang luka atau melalui rongga-rongga di bagian tip cap. Suhu pengeringan yang rendah, kadar air jagung >14%, adanya kolonisasi dan penetrasi C. sakazakii pada jagung dapat berkontribusi pada adanya kontaminasi bakteri tersebut pada produk jagung kering.

UCAPAN TERIMA KASIH

Ucapan terimakasih disampaikan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi atas pendanaan penelitian ini melalui skema Hibah Kompetensi tahun 2012.

DAFTAR PUSTAKA

Arku B, Mullane N, Fox E, Fanning S, Jordan K. 2008. Enterobacter sakazakii survives spray drying. Int J Dairy Technol. 61: 102-108.

Arroyo C, Condon S, Pagan R. 2009. Thermobacteriogical characterization of Enterobacter sakazakii. J Food Microbiol. 136:110-118. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2009.09.013.

[BAM] Bacteriological Analytical Manual. 2001. Chapter 3: Aerobic Plate Count. http://www.cfsan.fda.gov/

Bowen AB and Braden CR. 2006. Invasive Enterobacter sakazakii diseases in infants. Emerg Infect Dis. 12 :1185-1189.

[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2009. SNI 7388-2009: Batas maksimum cemaran mikroba dalam pangan.

   

[CAC] Codex Alimentarius Commission. 2008. Code of Hygienic Practice for Powdered Formulae for Infants and Young Children. Cac/Rcp 66 – 2008. Chang CH, Chiang ML, Chou CC. 2009a. The effect of temperature and length of

heat shock treatment on the thermal tolerance and cell leakage of Cronobacter sakazakii BCRC 13988. Int J Food Microbiol. 134: 184–189. doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2009.06.005.

Chang CH, Chiang ML, Chou CC. 2009b. The effect of heat shock on the response of Cronobacter sakazakii to subsequent lethal stresses. Foodborne Path Dis. 7: 71-76. doi:10.1089/fpd.2009.0345.

Clontech. Certificate of Analysis pGFPuv. http://www.clontech.com [2 Februari 2012].

Cooper CR, Daugherty AJ, Tachdjian S, Blum PH, Kelly RM. 2009. Role of vapBC toxin–antitoxin loci in the thermal stress response of Sulfolobus solfataricus. Biochem Soc Trans. 37: 123–126. doi:10.1042/BST0370123 CrameriA, WhitehornEA, Tate E, Willem PC, StemmerWPC. 1996. Improved

green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling. Nat Biotechnol. 14: 315 - 319

Dewanti-Hariyadi R, Gitapratiwi D, Meutia YR, Hidayat SH, Nurjanah S. 2010. Isolation of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) from powdered infant formula and other dried foods obtained from Bogor area. In: International Seminar on Current Issues and Challenges in Food Safety: science-based approach for food safety management. October 3-4, IPB International Conference Center, Bogor, Indonesia. Southeast Asian Food and Agricultural Science and Technology (SEAFAST) Center, Bogor, Indonesia

Dewanti-Haryadi R, Larasati F, Nuraida L. 2012. Survival of Cronobacter sakazakii in skim milk during spray drying, storage and reconstitution. J Teknol Indust Pangan. 13:186-192. ISSN 1979-7788.

Ehrenberg M. 2008. Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry : The green fluorescent protein: discovery, expression and development. The Royal Swedish Academy of Sciences, Stockholm, Sweden. p: 1-15

Emami CN and Mittal R. 2012. Role of neutrophils and macrophages in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis caused by Cronobacter sakazakii. J Surg Res. 172 (1): 18–28

Estuningsih S, Kress C, Hassan AA, Akineden Ö, Schneider E, Usleber E. 2006.

Enterobacteriaceae in dehydrated powdered infant formula manufactured in Indonesia and Malaysia. J Food Protection. 69:3013-3017.

[FAO-WHO] Food and Agriculture Organization – World Health Organization. 2004. Enterobacter sakazakii and other microorganisms in powdered infant formula: meeting report, MRA series6. WHO, Geneva, Switzerland.

Fiegen M. 2010. Untersuchungen zum Vorkommen und zur Tenazität von Cronobacter spp. [Dissertation]. Hamburg: Universität Hamburg Fachbereich Chemie.

Gitapratiwi D, Dewanti-Hariyadi R, Hidayat SH. 2012. Genetic relatedness of

Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) isolated from dried food products

in Indonesia. Int Food Research J. 19: 1745-1749.

Hamdani FW. 2012. Evaluasi Keragaman Genetika Isolat Lokal Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) yang diperoleh dari Produk Pangan Kering. Tesis. Bogor: Fakultas Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

   

Iversen C and Forsythe SJ. 2004a. Isolation of Enterobacter sakazakii and other Enterobacteriaceae from powdered infant formula milk and related products. Food Microbiol. 21: 771-777. doi.org/10.1016/j.fm.2004.01.009.

Iversen C, Lane M, Forsythe SJ. 2004b. The growth profile, thermotolerance and biofilm formation of Enterobacter sakazakii grown in infant formula milk. Lett Appl Microbiol. 38: 378–382. doi:10.1111/j.1472-765X.2004.01507.x

Iversen C, Mullane N, McCardell B, Tall BD, Lehner A, Fanning S, Stephan R and Joosten H. 2008. Cronobacter gen. nov., a new genus to accommodate the biogroups of Enterobacter sakazakii, and proposal of Cronobacter

sakazakiigen. nov., comb. nov., Cronobacter malonaticus sp. nov., Cronobacter turicensis sp. nov., Cronobacter muytjensii sp. nov., Cronobacter dublinensis sp. nov., Cronobacter genomospecies 1, and of

three subspecies, Cronobacter dublinensis subsp. dublinensis subsp. nov.,

Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis subsp. nov. and Cronobacter dublinensis subsp. lactaridi subsp. nov. Int J Syst Evol Micr. 58: 1442-1447.

Jung JH, Choi NY, Lee SY. 2013. Biofilm formation and exopolysaccharide (EPS) production by Cronobacter sakazakii depending on environmental conditions. Food Microbiol: 34: 70-80. http://dx.doi.org/10.1016/j.fm. 2012.11.008

Keith RC, Hilo M, Nishijima KA, Keith LM, . Nishijima WT, Wall MM. 2008. Atypical internal yellowing of papaya fruit in Hawaii caused by Enterobacter sakazakii. Plant Dis. 92: 487.1 - 487.1. http://dx.doi.org/10.1094/PDIS-92-3-0487A

Kuklinsky-Sobral J, Araújo WL, Mendes R, Geraldi IO, Pizzirani-Kleiner AA, Azevedo JL. 2004. Isolation and characterization of soybean-associated bacteria and their potential for plant growth promotion. Environ Microbiol. 6: 1244–1251. doi:10.1111/j.1462-2920.2004.00658.x

Ma L, Zhang G, Doyle MP. 2011. Green fluorescent protein labeling of Listeria, Salmonella, and Escherichia coli O157:H7 for safety-related studies. PLoS ONE. 6(4): e18083. doi:10.1371/journal.pone.0018083.

Meutia YR, Dewanti-Hariyadi R, Estuningsih S. 2008. Characterization of 16S rRNA gene of Enterobacter sakazakii isolated from powdered infant formula. Dalam : Abstrak Seminar Nasional PATPI. 14-16 Oktober, Palembang, Indonesia. Perhimpunan Ahli Teknologi Pangan Indonesia, Jakarta, Indonesia Meutia, Y. R., Dewanti-Hariyadi, R. and Estuningsih, S. 2009. Pengaruh suhu

rekonstitusi terhadap isolat lokal Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) asal susu formula dan makanan bayi. Warta Industri Hasil Pertanian 26(1): 22-30

Nifosí R, Tozzini V, Beltram F. 2005. Fluorescent Proteins. p: 235–244. Dalam : Encyclopedia Of Condensed Matter Physics. Bassani F, Liedl GL, Wyder P (eds). Elsevier .

Nurjanah S, Suhartono MT, Dewanti-Hariyadi R, Estuningsih S. 2012. Construction of GFPuv-labeled Cronobacter sakazakii and Cronobacter muytjensii. International Seminar of Food Factors, SEAFAST Center. Jakarta, 3-4 Oktober. SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Nurjanah S, Dewanti-Hariyadi R, Estuningsih S, Suhartono MT. 2013. Cytotoxic activity of food isolates Cronobacter sakazakii and Cronobacter muytjensii from Indonesia. 13^th Asean Food Conference 2013, Meeting Future Food

   

Demands : Security and Sustainability. Singapore, 9-11 September. Singapore Institute of Food Science and Technology, Singapore.

Penna TCV, Ishii M, Junior AP, Cholewa O. 2004. Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values. Appl Biochem Biotech. 114: 469-483.

Rahmawati, Dewanti-Hariyadi R, Hariyadi P, Fardiaz D, Richana N. 2013. Isolation and identification of microorganisms during spontaneous fermentation of maize. J Teknol Indust Pangan. 24:33-39. doi:10.6066/jtip. 2013.24.1.33.

Restaino L, Frampton EW, Lionberg WC, Becker RJ. 2006. A chromogenic plating medium for the isolation and identification of Enterobacter sakazakii from foods, food ingredients, and environmental sources. J Food Prot. 69: 315–322.

Sarah TS. 2013. Kajian pembuatan maizena dari jagung kuning dan sintas mutan Cronobacter spp. selama pembuatan maizena [skripsi]. Bogor :Institut Pertanian Bogor.

Schmid M, Iversen C, Gontia I, Stephan R, Hofmann A, Hartmann A, Jha B, Eberl L, Riedel K, Lehner A. 2009. Evidence for a plant-associated natural habitat for Cronobacter spp. Res Microbiol.160: 608-614. doi:10.1016/j. resmic.2009.08.013

Seftiono H. 2012. Ketahanan panas Cronobacter spp. (Enterobacter sakazakii) dalam susu formula dan sistem buffer dengan berbagai aw dan pH [tesis]. Bogor :Institut Pertanian Bogor.

Shimomura O. 2005. The discovery of aequorin and green fluorescent protein. J Microscopy, 217:3–15. doi: 10.1111/j.0022-2720.2005.01441.x

Spinelli F, Donati I, Vanneste JL, Costa M, Costa G. 2010. Real time monitoring of the interaction between P. syringae pv. Actinidiae and Actinidia species. In: VII International Symposium on Kiwifruit/ Acta Horticulturae 913. September 12-17, Faenza, Italy. International Society for Horticultural Science, Brussels, Belgium.

Vialette M, Jandos-Rudnik AM, Guyard C, Legeay O, Pinon A and Lange M. 2004. Validating the use of green fluorescent-marked Escherichia coli O157:H7 for assessing the organism behaviour in foods. J Appl Microbiol. 96, 1097–1104. doi:10.1111/j.1365-2672.2004.02245.x

Wan-Ling H, Chang CH, Chou CC. 2010. Heat shock effects on the viability of Cronobacter sakazakii during the dehydration, fermentation, and storage of lactic cultured milk products. Food Microbiol. 27 : 280-285.doi:10.1016/j.fm. 2009.10.011

   

Tabel 4.1 Karakteristik isolat dan plasmid yang digunakan

No Kode Isolat1) /Plasmid GenBank Accession Number Sumber Aktivitas Sitotoksik toksin2) Referensi

1 YRt2a/ JF800182 Susu Formula Negatif Meutia et al. 2008

2 FWHd16/ JX535018 Lada bubuk Positif Hamdani 2012

3 Plasmid GFPuv Clontech, USA

1) Koleksi SEAFAST Center 2) Nurjanah et al. 2013

Tabel 4.2 Profil mikrobiologi pada jagung dan inokulum Total Mikroba (log CFU/g) 5.2 ± 0.4 Jagung

Total Mikroba Resisten Ampisilin(log CFU/g)

3.9 ± 0.04 Jumlah mutan (CFU/ml) 8.3 ± 0.4 Inokulum mutan

YRt2a Kestabilan

mutan (%) ^{96 ± 0}

Jumlah mutan (CFU/ml) 8.1 ± 0.3 Inokulum mutan

FWHd16 Kestabilan mutan (%) 95 ± 4.2 Nilai merupakan rata-rata ± standar deviasi

Tabel 4.3 Jumlah C. sakazakii yang berpenetrasi

Jumlah Koloni pada Pengeringan Hari ke- (CFU/g)

Suhu Pengeringan Ulangan

1 2 3 4 YRt2a 1 na¹⁾ 33 7 94 40 oC 2 16 0²⁾ 0 0 1 4400 16 1 0 45 ^oC 2 3 0 0 0 1 88 3 3 0 50 ^oC 2 3 0 0 0 FWHd16 1 na 110 410 150 40 ^oC 2 22 na 0 na 1 4300 120 3 0 45 ^oC 2 90 200 0 na 1 na na 25 0 50 oC 2 21 50 12 0

1) na : not applicable; hasil analisis tidak dapat digunakan karena kontrol negatif mengandung koloni fluoresens

    R² = 0.9705 R² = 0.9473 R² = 0.9677 0 5 10 15 20 25 30 35 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Pengeringan Hari

ke-Ka d a r Ai r (% ) 0 5 10 15 20 25 30 35 0 1 2 3 4 5

Pengeringan Hari

ke-Ka d a r Ai r (% ) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 aw

Gambar 4.1 Peta plasmid pGFPuv (Clontech 2012)

A B

Gambar 4.2 (A) Grafik penurunan kadar air ♦ 40oC ; y=-2.07x + 32 ■ 45oC; y=-3.12x + 32 ▲50^oC; y=-5.36x + 31; dan (B) Grafik penurunan aw pada pengeringan suhu 50^oC ; ● kadar air ; ■ aw

    0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 Awal 0 1 2 3 4 5 6 7 8

Pengeringan Hari

ke-T o tal M ikr o b a al am iah (l og C FU /g)

Gambar 4.3 Perubahan jumlah mikroba alamiah selama pengeringan jagung; ♦ suhu 40^oC ■ suhu 45^oC ▲suhu 50^oC

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 setelah inokulasi 1 2 3 4 5 6 7

Pengeringan Hari

ke-Jum lah Y R t2 a ( log C F U /g) A 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 setelah inokulasi 1 2 3 4 5 6 7 8

Pengeringan Hari

ke-Ju m lah F W H d 16 ( lo g C F U /g )   B

Gambar 4.4 Penurunan jumlah (A) C. sakazakii YRt2a dan (B) C. sakazakii FWHd16 selama pengeringan; ♦ suhu 40^oC ■ suhu 45^oC ▲suhu 50^oC

   

Gambar 4.5 Kurva Ketahanan C. sakazakii pada Suhu Pengeringan; (A) 40^oC, (B) 45^oC dan (C) 50^oC; ♦ YRt2a ■ FWHd16 A  B  C  y = -0.8038x R² = 0.9269 y = -0.667x R² = 0.8773 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 P e rb an di n g an Ju m la h N t / N o ( log) y = -1.0579x R² = 0.9569 y = -0.8893x R² = 0.9056 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 P er b an d in g an Ju ml ah N t /N o ( log) y = -1.3427x R² = 0.9278 y = -1.1347x R² = 0.9678 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 1 2 3 4

Pengeringan Hari

ke-P er b an d in g a n Ju m lah N t /N o (l o g ) A C B

   

Gambar 4.6 Pengamatan SEM (500x), (A) Kolonisasi C. sakazakii pada permukaan pericarp jagung (B) Rongga pada bagian tip cap jagung (C) Kolonisasi C. sakazakii pada permukaan tip cap jagung;

sel C. sakazakii rongga

B C

   

Gambar 4.7 Pengamatan mikroskop fluoresens (1000x)

(A) Kolonisasi C. sakazakii pada pemukaan jagung suhu 40^oC, (B) Kolonisasi C. sakazakii pada pemukaan jagung suhu 50^oC, (C) Kolonisasi C. sakazakii pada bagian yang Luka

  100 μm  A  B  100 µm 100 µm C

meliputi kegiatan isolasi isolat Cronobacter spp. dari beberapa produk pangan serta piranti penyajian susu formula serta identifikasi secara biokimia dan molekular (Estuningsih et al. 2006, Meutia et al. 2008, Gitapratiwi et al. 2012 dan Hamdani (2012), kajian karakteristik ketahanan panas meliputi ketahanan panas saat proses produksi dan rekonstitusi susu formula, ketahanan terhadap suhu dan kelembaban selama penyimpanan (Meutia et al. 2009, Dewanti-Hariyadi et al. 2012, Seftiono 2012), kemampuan berkompetisi dengan bakteri asam laktat (Saputra 2012, Riyanti 2012) serta kajian awal tentang sitotoksisitas (Grecilia 2008, Wardanela 2008). Berdasarkan dari beberapa penelitian tersebut, dalam penelitian ini dilakukan kajian lebih lanjut tentang aktivitas sitotoksik dan aktivitas hemolitik yang mengindikasikan patogenisitas bakteri tersebut. Sitotoksitas ini dilihat kaitannya dengan ketahanan hidup selama pengeringan jagung, kemampuan kolonisasi dan penetrasi ke dalam jagung. Untuk membedakan dengan mikrobiota dalam jagung, dalam kajian ini digunakan mutan Cronobacter spp. yang dilabel dengan Green Fluorescent Protein (GFP).

Pada penelitian ini digunakan 20 isolat dari 33 isolat koleksi yang tersedia (Lampiran 7) dengan pemilihan berdasarkan keragaman genetik dan keragaman asal pangan. Isolat yang sudah dikoleksi tersebut telah dikonfirmasi secara molekular berdasarkan analisis parsial sekuens gen 16SrRNA, 32 diantaranya termasuk dalam spesies Cronobacter sakazakii dan satu isolat termasuk ke dalam spesies Cronobacter muytensjii (Gitapratiwi et al. 2012, Hamdani 2012). Dendogram kekerabatan genetik koleksi isolat Cronobacter spp. digambarkan pada Gambar 5.1. Dari dendogram pada Gambar 5.1, isolat-isolat yang menunjukkan kedekatan genetik atau berada pada bootstrap yang sama, masing-masing hanya diambil satu isolat sebagai isolat uji. Sebagai contoh isolat pada bootsrap yang sama seperti isolat Desb10 dan Desb7a serta isolat YRw3 dan YRw1. Isolat yang berasal dari sumber pangan yang sama, diambil satu atau dua sesuai dengan jumlah yang diperlukan.

Aktivitas Sitotoksik dan Hemolitik Isolat Lokal Cronobacter sakazakii dan Cronobacter muytjensii asal Pangan

Patogenisitas bakteri Cronobacter spp. diduga berasal dari beberapa faktor virulensi yang umumnya berupa protein atau enzim yang mempunyai aktivitas tertentu, yaitu aktivitas penempelan (adhesin factor), aktivitas penembusan (invasin factor), dan toksin. Adanya adhesin dan invasin factor ditunjukkan dengan kemampuan bakteri ini melakukan penempelan dan invasi ke dalam sel epidermis yang ditunjukkan dengan perbedaan respons jika diuji pada kultur sel (Mange et al. 2006) dan sel di saluran pencernaan (Quintero 2011). Beberapa isolat Cronobacter spp. mempunyai perbedaan dalam tingkat virulensi terhadap sel tertentu (Mange et al. 2006). Penelitian terakhir menunjukkan adanya faktor virulensi lainnya yang ditunjukkan dengan gen penyandi protein hemolitik atau haemaglutinin pada plasmid (Yan et al. 2011, Franco et al. 2011), walaupun belum ada publikasi tentang aktivitas hemolitik bakteri ini secara fenotipik yang dikaitkan dengan patogenisitas.

 

Kajian tentang toksin Cronobacter spp. sudah dilaporkan oleh beberapa peneliti, baik tipe endotoksin maupun eksotoksin. Terdapat dua tipe endotoksin Cronobacter spp. yang merupakan bagian Lipid A dari lipopolisakarida (Cai 2013). Eksotoksin bakteri ini telah diuji kemampuannya dalam melakukan aktivitas sitotoksik (merusak sel eukariotik) dan aktivitas sitotonik (mengganggu keseimbangan homeostasis sel eukariotik). Eksotoksin bakteri ini yang diberikan secara oral pada tikus neonates dapat menyebabkan kerusakan pada organ usus, hati dan ginjal (Wardanela 2008). Namun, belum ada laporan mengenai aktivitas sitotoksik toksin dari Cronobacter spp. secara kuantitatif, sehingga dalam penelitian ini dilakukan kajian mengenai aktivitas sitotoksik secara kuantitatif.

Penelitian ini menggunakan sel Vero sebagai model sel uji, hal ini berdasarkan publikasi sebelumnya yang menunjukkan adanya efek sitotoksik toksin Cronobacter spp. pada sel Vero yang sangat jelas. Efek toksin tersebut terhadap sel Vero lebih tinggi dibandingkan terhadap sel Y-1 dan sel CHO (Pagotto et al. 2003). Kerusakan pada sel Vero ditunjukkan dengan perubahan morfologi sel dan terlepas dari tempatnya melekat (Pagotto et al. 2003). Grecilia (2008) yang menguji hal yang sama pada 12 isolat lokal Cronobacter spp. asal makanan pendamping ASI, 6 isolat diantaranya menunjukkan aktivitas kerusakan pada sel Vero. Bahkan, 5 dari isolat tersebut masih mempunyai aktivitas toksin setelah dipanaskan selama 20 menit.

Aktivitas sitotoksik bakteri dapat ditunjukkan oleh persentase jumlah sel yang rusak atau mati akibat pengaruh toksin dibandingkan dengan jumlah sel kontrol (tanpa perlakuan). Pengukuran aktivitas ini dapat berdasarkan jumlah sel yang mati atau berdasarkan jumlah sel yang hidup. Sebagai contoh metode pengukuran berdasarkan pada jumlah sel mati adalah dengan menggunakan metode hitungan mikroskopik haemacytometer dengan pewarnaan tryphan blue. Pewarna ini dapat masuk dan mewarnai sitoplasma sel yang mati, sehingga sel yang mati berwarna biru dan sel yang hidup berwarna terang. Penghitungan dengan cara ini tidak efektif dilakukan untuk jumlah isolat uji yang banyak karena kisaran nilai terlalu kasar dan menyebabkan mata lelah.

Pada penelitian ini digunakan pengukuran berdasarkan jumlah sel yang hidup yaitu dengan metode MTT Assay. Metode ini menggunakan prinsip spektrofotometri yang mengukur aktivitas sitotoksik berdasarkan aktivitas enzim dehidrogenase pada mitokondria sel hidup. Enzim ini dapat mengubah pereaksi MTT menjadi kristal formazan yang berwarna biru dan diukur absorbansinya. Absorbansi yang terukur menunjukkan jumlah sel yang masih hidup. Metode MTT telah digunakan untuk mengukur aktivitas sitotoksik sel vegetatif dan juga toksin bakteri. Untuk sel vegetatif dilakukan pada Aeromonas spp. (Krzyminska et al. 2011), E. coli (Ghadir et al. 2010a), Staphylococcus spp. dan Pseudomonas spp. (Ghadir et al. 2010b). Untuk aktivitas sitotoksik dilakukan untuk pengujian toksin murni Clostridium difficile (Hurtado et al. 2008), Shiga toksin (Sekino et al. 2004) atau dari supernatan bebas sel pada E. coli (Ghadir et al. 2010a), Aeromonas spp. (Coute 2007, Magda et al. 2009). Beberapa penelitian tersebut berbeda dalam mengklasifikasikan aktivitas sitotoksik ini. Couto et al. (2007) menyatakan aktivitas sitotoksik dinyatakan positif jika menyebabkan lebih dari 50% kematian sel Vero, dan (Hurtado et al. 2008) menyatakan positif jika nilai Absorbansinya lebih kecil dari nilai Absorbansi kontrol tanpa toksin.

 

Penelitian ini menggunakan kontrol positif isolat yang sudah diketahui mempunyai aktivitas sitotoksik toksin yaitu Salmonella typhimurium ATCC14028 yang memproduksi enterotoksin. Kontrol negatif adalah medium pertumbuhan sel (Tryptic Soy Broth) tanpa toksin dan Cronobacter muytjensii ATCC 51329. Hasil pengujian terhadap 20 isolat Cronobacter spp. menunjukkan bahwa isolat uji mempunyai aktivitas sitotoksik yang beragam antara 32%-80% (relatif terhadap Salmonella spp.) (Gambar 2.1) (Lampiran 1). Dari 20 isolat uji, sebanyak 13 isolat (65%) positif mempunyai aktivitas sitotoksik yaitu dengan aktivitas sitotoksik di atas 51% (lebih besar dari kontrol negatif) dan 7 isolat dinyatakan negatif karena nilai aktivitasnya di bawah nilai aktivitas kontrol negatif (di bawah 51%). Lima isolat dengan aktivitas sitotoksik toksin tertinggi adalah FWH b6, E2, FWHb15, FWHc3 dan FWHd16 masing-masing sebesar 80%, 78%, 76%, 73% dan 70%. Aktivitas ini masih di bawah Shiga toksin dengan nilai lebih dari 80% (Sekino et al. 2004). Perbedaan sitotoksisitas strain Cronobacter spp. terhadap sel Vero juga dilaporkan oleh peneliti lain. Pagotto et al. (2003) menemukan hanya satu dari dua strain Cronobacter spp. yang positif toksik terhadap sel Vero, sementara Yang et al. (2009) menemukan tiga dari delapan (38%) yang strain Cronobacter spp positif toksik terhadap sel Vero.

Dari data tersebut, ada atau tidaknya aktivitas sitotoksik toksin tidak terkait dengan sumber isolat. Lima isolat dengan aktivitas sitotoksik toksin tertinggi FWH b6, E2, FWHb15, FWHc3 dan FWHd16, masing-masing berasal dari tepung terigu, makanan pendamping ASI, gula pasir, tapioka dan lada bubuk. Isolat dengan aktivitas terendah adalah YRt2a berasal dari susu formula, sedangkan tiga isolat lain asal susu formula menunjukkan positif sitototoksik. Apabila dibandingkan dengan dendogram keragaman genetik berdasarkan sekuens gen 16SrRNA (Gitapratiwi et al. 2012), tidak terlihat adanya korelasi antara ada dan tidaknya aktivitas sitotoksik dengan kedekatan gen 16Sr RNA.

Kerusakan sel Vero dilihat lebih jauh dengan pewarnaan Haematoxylin Eosin yang dapat membedakan sel yang mati dan sel yang hidup dan membedakan bagian sitoplasma dan bagian inti sel. Terdapat dua tipe kerusakan sel, yaitu pertama sel yang mengalami degenerasi atau hanya kerusakan sitoplasma dan kedua sel yang mengalami kematian dengan nukleus yang mengalami kerusakan sehingga DNA nya terurai. Belum ada publikasi mengenai struktur toksin dan mode aksi toksin Cronobacter spp..

Purifikasi dan karakterisasi toksin Cronobacter spp. telah dilakukan oleh Raghav et al (2007) dengan menggunakan kolom pertukaran ion DEAE cellulose dan Sephadex™ G-100 dan diketahui mempunyai berat molekul 66 kDa. Ukuran toksin tersebut mirip dengan polimer toksin dari E. cloacae yaitu 66 kDa (Paraje 2005) dan Pseudomonas spp. (Fryling et al. 1992). Apabila dilihat dari kemiripan ukuran beberapa toksin tersebut, maka diduga struktur protein dan mode aksi toksin Cronobacter spp. mirip dengan toksin dari E. cloacae. Toksin E. cloacae berukuran 66 kDA merupakan protein oligomer yang terdiri dari 4 subunit (tetramer) serta mempunyai kemampuan membuat pori pada permukaan sel darah merah (Paraje 2005). Di samping protein oligomer tersebut, pada E. cloacae tersebut terdeteksi juga protein monomer berukuran 13,3 kDa yang diduga sebagai protein aktif yang mempunyai aktivitas sitolitik pada sitoplasma (Paraje 2005). Mekanisme pembentukan pori ini banyak dilaporkan sebagai mode aksi toksin dari beberapa bakteri Gram negatif. Struktur protein umumnya terdiri dari 2

 

subunit, yaitu subunit besar (tetramer) yang disebut Binding site dengan inisial huruf ”B” yang berfungsi melekat pada memran sel dan membentuk pori dan subunit kecil disebut Active site dengan inisial huruf ”A” yang mempunyai aktivitas enzimatik dengan target pada sitoplasma sel (Gonzales et al. 2007).

Efek sitotoksik terhadap sel Vero ini dilihat lebih jauh jika toksin diekstrak pada umur kultur bakteri yang berbeda dan lebih lama. C. sakazakii toksik FHWd16 dan FWHc3, dan nontoksik YRt2a serta C. muytjensii FWHd11 diinkubasi selama 24, 40 dan 48 jam, kemudian diekstrak toksinnya dan masing-masing diujikan pada sel Vero. Untuk C. sakazakii FHWd16 dan FWHc3, efek sitotoksik terhadap sel Vero semakin meningkat dengan meningkatnya umur kultur bakteri tersebut, hal ini diduga karena adanya akumulasi dari toksin yang dihasilkan. Untuk C. sakazakii nontoksik YRt2a, perpanjangan waktu inkubasi sampai 48 jam tersebut tetap tidak menunjukkan adanya efek toksin. Untuk C. muytjensii FWHd11 yang nilai aktivitas sitotoksiknya relatif menengah, perpanjangan waktu inkubasi sampai 48 jam tersebut tidak menunjukkan adanya peningkatan efek toksin. Peningkatan aktivitas toksin dengan meningkatnya wakti inkubasi ini tidak selalu terjadi pada semua kelompok bakteri penghasil toksin. Pada bakteri tertentu penambahan waktu inkubasi bisa menurunkan aktivitas toksin karena adanya degradasi toksin oleh metabolit yang dihasilkan bakteri, misalnya adanya asam.

Hasil penelitian tahap ini menunjukkan aktivitas toksisitas dan hemolitik yang mengindikasikan potensi virulensi Cronobacter spp.. Dalam penelitian ini, tahap ini sebagai karakterisasi awal dari patogenisitas sebagai dasar dari pemilihan isolat yang bersifat toksik dan nontoksik untuk dipelajari perilakunya