4. HASIL DAN PEMBAHASAN 1 Preparasi Organ Dalam 1 Preparasi Organ Dalam
4.2 Ekstraksi Kolagenase
Ekstraksi merupakan tahap awal pemurnian kolagenase, secara terpisah terhadap tiga organ dalam, yaitu hati, usus dan pilorik kaeka ikan bandeng yang telah berada pada fase post rigor. Pada penelitian ini, ekstraksi kolagenase menggunakan buffer Tris-HCl dengan pH 8,0 untuk menjaga lingkungan enzim, sehingga tidak terjadi perubahan pH yang ekstrim selama proses ekstraksi. Triton X-100 sebesar 0,25% w/v ditambahkan untuk memisahkan enzim kolagenase yang masih melekat pada dinding sel atau sisa polimer substrat (Suhartono 1989). Selanjutnya sebesar CaCl2 100 mM ditambahkan dalam proses ekstraksi untuk menjaga kemungkinan terjadinya penurunan aktivitas enzim, sebab ion Ca2+ dapat digunakan sebagai kofaktor (Bollag & Edelstein 1991). Penampang organ dalam ikan bandeng disajikan pada Lampiran 4.
Hasil ekstraksi berupa ekstrak kasar kolagenase. Ekstrak kasar tersebut kemudian diuji aktivitas kolagenasenya. Hasil uji aktivitas kolagenase terhadap ekstrak kasar kolagenase memperlihatkan bahwa terdapat aktivitas kolagenase pada ketiga organ dalam tersebut. Aktivitas kolagenase beberapa organ dalam dapat dilihat pada Gambar 11. Aktivitas kolagenase tertinggi terdapat pada usus yaitu sebesar 0,141 Unit/ml dan konsentrasi proteinnya adalah 1,712 mg/ml.
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 sisa organ dalam usus pilorik kaeka hati Organ dalam A k ti vi ta s kol agenas e U n it /m
Gambar 11 Aktivitas kolagenase pada berbagai organ dalam ikan bandeng fase post rigor.
Kolagenase diproduksi oleh sel-sel jenis sel stromal, sel ephitel, makrofagus dan leukosit (Strenlicht & Werb 2001). Usus adalah organ pencernaan yang terbangun dari sel-sel epitelium. Khojasteh et al. (2009)
30
melaporkan bahwa secara histologi, struktur dinding sel usus halus pada ikan rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hampir sama dengan hewan vertebtara lain. Usus halus merupakan tempat sebagian pencernaan secara kimiawi terjadi. Sebagian besar enzim pencernaan yang bekerja pada usus disekresikan oleh pankreas melalui pankreatik duct.
Khojasteh et al. (2009) juga menyatakan usus halus terbentuk dari mukosa tonika dangan jaringan penghubung tonika muskularis (di bagian dalam berbentuk lingkaran, di bagian luar searah dengan daging) dan lapisan tonika serosa. Mukosa muskolaris terdapat diantara lamina propria dan submukosa, dan kelenjar mukosal turbular. Lapisan tipis jaringan penghubung bersifat asam memisahkan mukosa dan sub mukosa. Pada permukaan mukosa terdapat villi, mengurangi lebar bagian depan dan ujung usus, dan epitelium yang membentuk lapisan tunggal kolom sel dengan basal nukleus yang mengandung nukleus, garis apical brush dan sitoplasma asidofilik. Kolagenase dari usus ini selanjutnya digunakan oleh organ-organ tertentu yang memerlukannya dengan mekanisme transport sel. Penampang dinding usus disajikan pada Gambar 12.
Gambar 12 Penampang dinding usus.
Sumber:http://www.anselm.edu/homepage/jpito cch/genbio/intestwallcells.JPG. [5 Februari 2010]
Kandungan enzim protease tinggi, pada jeroan dan daging. Jeroan (organ dalam) ikan mempunyai prosentase yang besar, yaitu sekitar 5%. Proteinase telah ditemukan dalam usus ikan, seperti tripsin, kimotripsin, kolagenase, elastase,
karboksipeptidase dan karboksi esterase, yang secara normal disekresikan oleh pilorik kaeka dan pankreas (An & Vessesanguan 2000).
Terdapat aktivitas kolagenase pada sisa organ dalam yaitu campuran organ seperti ginjal, lambung, pankreas, dan empedu. Adanya aktivitas tersebut, menandakan bahwa pada organ-organ tersebut juga merupakan sumber kolagenase. Kolagenase telah dimurnikan dengan metode yang berbeda pada hepatopankreas udang (Pandalus eous) (Aoki et al. 2003) dan hepatopankreas kepiting raja (Paralithodes camtschaticus) (Rudenskaya et al. 2004). Beberapa sumber kolagenase dari hewan perairan dan metode pemurniannya disajikan pada Tabel 7.
Tabel 7 Sumber kolagenase dan metoda pemurniannya. Sumber Metode pemurnian Kelipatan
pemurnian
Yield (%) Organ dalam ikan makarel
(Scomber japanicus) Park et al. (2002).
pengendapan aceton; Penukar ion DEAE Sephadex A-50; Gel filtrasi
Sephadex G-100; Penukar ion DEAE Sephacel; Gel
filtrasi G-75
39,5 0,1
Organ dalam ikan filefish (Novoden modestrus) Kim et
al. (2002) .
pengendapan ammonium sulfat; Penukar ion DEAE
Sephadex A-50 dua kali; Gel filtrasi Sephadex G-150
92,4 10,9
Pilorik kaeka ikan tuna(Thunnus thynnus) Byun et
al. (2002)
pengendapan aceton; gel filtrasi Sephadex G-100;penukar ion DEAE Sephadex A-50;gel filtrasi
Sephadex G-75
30,5 0,023
Hepatopancreas udang (Pandalus eous) Aoki et al.
(2003)
pengendapan aceton; kolom hydroxypapatite; kolom
MonoQ
37,4 2,9
4.3. Pengendapan
Pengendapan ekstrak kasar kolagenase dari usus ikan bandeng garam ammonium sulfat (NH4(SO4)2). Konsentrasi NH4(SO4)2 yang ditambahkan yaitu dari 30 sampai dengan 80% (w/v) tingkat kejenuhan NH4(SO4)2. Ammonium
32
sulfat dipilih karena sifatnya yang mudah larut, murah dan umumnya tidak mempengaruhi struktur protein pada konsentrasi tertentu (Beynon & Bond 2000).
Penambahan ammonium sulfat pada ekstrak kasar menghasilkan endapan dan supernatan, yang masing-masing diuji aktivitas kolagenasenya. Hasil uji aktivitas terhadap hasil pengendapan diperoleh aktivitas tertinggi terdapat pada endapan dengan penambahan 70% (w/v) tingkat kejenuhan NH4(SO4)2, yaitu sebesar 0,496 unit/ml dengan konsentrasi protein sebesar 1,185 mg/ml, dan aktivitas spesifiknya 35,42 Unit/mg. Meningkatnya aktivitas enzim pada endapan hingga penambahan ammonium sulfat 70% disebabkan berkurangnya pengotor, seperti non protein (karbohidrat), protein non enzim dan lain-lain (Suhartono 1989). Konsentrasi protein pada hasil pengendapan menggunakan ammonium sulfat 30-80% disajikan pada Gambar 13.
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400 1,600 30 40 50 60 70 80
Konsentrasi Ammonium sulfat % kejenuhan
K o ns en tr as i p ro tei n m g /m
Gambar 13 Konsentrasi protein pada hasil pengendapan menggunakan ammonium sulfat 30-80%. endapan supernatan
Aktivitas kolagenase pada konsentrasi ammonium sulfat tingkat kejenuhan 80% menurun. Penurunan ini disebabkan karena ammonium sulfat tidak bersifat buffer dan dapat membebaskan ammonia, sehingga memungkinkan terjadinya kenaikan pH (Boyer 1993). Ammonium sulfat dipilih karena sifatnya yang mudah larut, murah dan umumnya tidak mempengaruhi struktur protein pada konsentrasi tertentu (Beynon & Bond 2000). Akibatnya, aktivitas enzim menjadi menurun, karena aktivitasnya tersebut dipengaruhi oleh faktor lingkungan, seperti pH. Aktivitas enzim menurun ketika pH lingkungan enzim melebihi pH
supernatan
optimumnya. Hasil uji aktivitas kolagenase pada endapan dan supernatan larutan enzim kolagenase yang ditambah dengan NH4(SO4)2 dalam berbagai tingkat kejenuhannya disajikan pada Gambar 14.
0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 30 40 50 60 70 80
Konsentrasi ammonium sulfat % kejenuhan
A k ti v it as kol agenase U n it /m
Gambar 14 Aktivitas kolagenase (Unit/ml) hasil pemisahan dengan pengendapan menggunakan NH4(SO4)2 . endapan
Kim et al. (2002) mengendapkan ekstrak kasar kolagenase dari organ dalam ikan filefish (Novodon modestrus) menggunakan garam NH4(SO4)2 secara bertingkat dari 30% hingga 80% w/v tingkat kejenuhan. Park et al. (2002) menggunakan aseton dingin untuk mengendapkan ekstrak kasar kolagenase dari organ dalam ikan makarel (Scromber japanicus). Aktivitas spesifik pada pengendapan ekstrak kolagenase dari ikan filefish yaitu 145,34 Unit/mg, lebih besar dibandingkan aktivitas spesifik ekstrak kasar kolagense dari ikan makarel, yaitu 42,3 Unit/mg.
4.4 Dialisis
Dialisis dilakukan untuk mengurangi kadar garam (desalting) yang tersisa dari pengendapan menggunakan garam NH4(SO4)2. Perbedaan tekanan osmosis dari larutan buffer yang mengandung konsentrasi garam rendah (hipotonik) dengan larutan enzim dalam kantong dialisis yang mengandung garam tinggi (hipertonik) menyebabkan garam terdifusi keluar membran kantung dialisis, biasanya bersifat semipermeabel. Dialisis mengeluarkan protein dengan ukuran yang lebih kecil dari ukuran pori-pori kantung dialisis. Dialisis yang dilakukan
34
dengan mengganti buffer beberapa kali akan meningkatkan kemurnian enzim (Syukri 1999).
Lama waktu diffusi dan ukuran kantong dialisis serta konsentrasi buffer menentukan hasil dialisis (Bollag & Edelstein 1991). Aktivitas kolagenase pada jenis ukuran kantong dan waktu dialisis disajikan pada Gambar 15.
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 8 mwco 12 mwco
Ukuran kantong dialisis
A k ti v it as kol agenas e U n it /m
Gambar 15 Aktivitas kolagenase pada jenis ukuran kantong dan waktu dialisis.
Aktivitas kolagenase hasil presipitasi adalah 0,496 U/ml. Setelah didialisis, aktivitas kolagenase mengalami penurunan. Dialisis selama 6 jam menggunakan kantong dialisis dengan ukuran 8 kDa MWCO, menghasilkan aktivitas tertinggi yaitu 0,451 U/ml dibandingkan dengan proses dialisis menggunakan kantong dialisis dengan ukuran 12kDa MWCO pada waktu yang sama yaitu 0,101 U/ml sedangkan proses dialisis selama 12 jam menggunakan kantong dialisis dengan ukuran 8 kDa MWCO, menghasilkan aktivitas kolagenase yaitu 0,289 U/ml dibandingkan dengan proses dialisis menggunakan kantong dialisis dengan ukuran 12 kDa MWCO pada waktu yang sama yaitu 0,079 U/ml.
Aktivitas kolagenase pada kantong yang sama yaitu 8 kDa dengan lama waktu dialisis yang berbeda menyebabkan terjadinya penurunan aktivitas kolagenase. Perlakuan fisik dapat menyebabkan turunnya aktivitas kolagenase. Pada ukuran kantong dialisis yang berbeda yaitu 12 kDa, aktivitas kolagenase mengalami penurunan yang cukup tinggi. Hal ini disebabkan karena kemungkinan adanya molekul-molekul enzim yang keluar bersamaan dengan keluarnya ion dari garam NH4(SO4)2.
