DAFTAR LAMPIRAN
1. PENDAHULUAN 1Latar Belakang
2.1 Klasifikasi Ikan Bandeng ( Chanos chanos, Forskal)
3.3.3 Ekstraksi Kolagenase Organ Dalam Ikan Bandeng (Kim et al. 2002) Organ dalam segar yang telah dipreparasi dan dipisahkan antara pilorik
kaeka, hepatopankreas dan usus, masing-masing ditambahkan buffer Tris-HCl (pH 8,0) yang terdiri dari 0,25 % Triton X-100 dan 10 mM CaCl2, perbandingan berat: volume (b/v) organ dalam:larutan buffer sama dengan 1:5 dan dihomogenisasi dengan homogenizer.
Langkah selanjutnya homogenat disentrifugasi pada 7000xg (konversi g ke rpm terlampir pada Lampiran 2) selama 20 menit pada suhu dingin (4 oC). Endapan diekstraksi kembali dengan penambahan buffer yang sama sebanyak 3xvolume endapan. Supernatan dari hasil sentrifugasi terakhir diambil kemudian ditambah dengan 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) yang terdiri dari 0,36 mM CaCl2 dan dibiarkan selama 48 jam pada suhu rendah (+4 oC). Hasil ekstraksi dianalisis aktivitas kolagenasenya dan dipilih organ dalam yang mempunyai aktivitas tertinggi untuk dimurnikan lagi dengan pengendapan dan dialisis.
3.3.4 Pengendapan dan Dialisis
Ekstrak kolagenase kasar selanjutnya dimurnikan dengan penambahan ammonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 30-80%, untuk menentukan konsentrasi garam optimal. Tabel penambahan ammonium sulfat sesuai persen kejenuhan dilampirkan pada Lampiran 3.
Pengendapan dilakukan dengan menambahkan garam ammonium sulfat padat ke dalam ekstrak kasar sedikit demi sedikit hingga dicapai konsentrasi ammonium sulfat yang diperlukan, yaitu 30%, 40%, 50%, 60%, 70% dan 80%. Selanjutnya larutan disentrifuse pada 12.000xg selama 30 menit. Endapan dan supernatan yang dihasilkan, diuji aktivitas kolagenasenya. Hasil pengendapan yang mempunyai aktivitas kolagenase tertinggi didialisis menggunakan kantong dialisis dengan ukuran molecular weight cut off (MWCO) yang sesuai.
Preparasi kantong dialisis dilakukan untuk menghilangkan sulfat yang mungkin terdapat pada kantong dialisis. Kantong dialisis dicuci menggunakan metoda Richmond et al. (1985), diacu dalam Bollag dan Edelstein (1991). Kantong dialisis direbus dalam larutan NaHCO3 2% yang mengandung EDTA 1 mM hingga seluruh kantong tercelup selama 10 menit. Kemudian larutan dibuang, dan kantung direbus dengan akuades selama 10 menit. Perebusan
dengan akuades ini dilakukan dua kali. Selanjutnya kantung dialisis didinginkan dan kantung siap digunakan.
Pemilihan kantong dan waktu dialisis yang tepat dilakukan agar terjaga aktivitas kolagenase tetap tinggi. Ukuran kantong dialisis yang diujikan adalah 8.000 dan 12.000 MWCO. Waktu yang diujikan adalah 6 dan 12 jam. Buffer yang digunakan adalah buffer tris HCl 2 mM mengandung CaCl2 0,036 mM, dengan volume 100 kali volume sampel (Scopes 1982).
3.3.5 Pemurnian dengan Kolom Kromatografi
Pemurnian enzim kolagenase dilakukan menggunakan kromatografi penukar ion dan gel filtrasi. Kromatografi penukar ion menggunakan kolom kromatografi berukuran 2,5x30 cm dengan media pendukung DEAE Sephadex A-50 yang diekuilibrasi menggunakan buffer 20 mM Tris-HCl dengan pH optimum. Matriks kolom dibuat dengan cara melarutkan 1,5 g dalam akuades bebas ion, selanjutnya perendaman dilakukan selama 12 jam. Matriks kemudian divakum selama 6 jam. Ukuran kolom adalah 1,5x40 cm. Pada awalnya, kolom dielusi menggunakan buffer tris HCl 20 mM pH 8,0 mengandung CaCl2 0,36 mM pada yang terlarut dalam akuades bebas ion, kolom dielusi menggunakan NaCl bergradien dari 0,1-0,7 mM dalam buffer yang sama. Kecepatan rata-rata pemisahan adalah 0,5 ml/menit dan volume fraksi 5 ml. Sebanyak 62 fraksi yang dihasilkan kemudian diukur. Kolom dicuci dan dielusi menggunakan NaCl secara bertahap (0-0,7 M) pada buffer yang sama. Kecepatan aliran adalah 0,5 ml/menit, dan volume fraksi yang ditampung sebanyak 5 ml. Seluruh fraksi yang dihasilkan diuji aktivitas kolagenasenya dan konsentrasi proteinnya pada panjang gelombang 280 nm.
Kromatografi gel filtrasi menggunakan matriks Sephadex G-100. Matriks kolom dibuat dengan melarutkannya 2 g dalam akuades, kemudian direndam selama 12 jam. Matriks kemudian divakum selama 6 jam. Ukuran kolom adalah 1,5x40 cm. Kolom dielusi menggunakan buffer tris HCl 20 mM pH 8,0 mengandung CaCl2 0,36 mM. Kecepatan rata-rata pemisahan adalah 0,5 ml/menit dan volume fraksi yang ditampung sebanyak 5 ml. Seluruh fraksi yang dihasilkan diuji aktivitas kolagenase dan konsentrasi proteinnya pada panjang gelombang 280 nm.
24
3.3.6 Karakterisasi Kolagenase Organ Dalam Ikan Bandeng
Karakterisasi bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum aktivitas kolagenase sehingga penggunaannya dapat disesuaikan dengan karakter tersebut. Selain itu juga untuk mengetahui dan mengontrol kemurnian pada setiap tahap dalam proses pemurnian. Karakterisasi kolagenase meliputi penentuan suhu optimum, pH optimum, pengaruh ion logam serta pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim kolagenase yang dihasilkan dari setiap tahap pemurnian. Adapun kisaran pH yang akan diujikan, yaitu 6,0-10,0; suhu 30-80 oC; pengaruh ion logam (NaCl, CaCl2 BaCl2, MnCl2 dan CoCl2) masing masing dengan konsentrasi 1 dan 2 mM; dan inhibitor EDTA, PMSF, dan pepstatin.
3.3.7 Analisis
Analisis yang dilakukan dalam penelitian ini terdiri atas uji aktivitas kolagenase, analisis kadar protein dan penentuan berat molekul.
(1) Uji aktivitas kolagenase (Moore dan Stein (1954) diacu dalam Kim et al. (2002)) yang dimodifikasi.
Aktivitas kolagenase dianalisis menggunakan metoda spektrofotometri. Sebanyak 0,1 ml larutan kolagenase ditambah dengan 5 ml larutan kolagen dan 1 ml 0,05 mM tris-HCl pada pH 8,0 yang mengandung 5 mM CaCl2. Reaksi ini dilakukan pada suhu 37 oC selama 1 jam. Reaksi dihentikan dengan penambahan 0,2 ml 0,5% TCA. Setelah 10 menit pada suhu ruang, larutan disentrifus pada 1.800 rpm selama 20 menit. Supernatan, sebanyak 1 ml dicampur dengan 1,0 ml larutan ninhidrin, diinkubasi pada suhu 100 oC selama 20 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang.
Campuran kemudian ditambah dengan 5 ml 50% 1-propanol dan diukur serapannya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm. Larutan buffer Tris-HCl digunakan sebagai blanko, dan L-leusin digunakan sebagai standar (asam amino hasil hidrolisis kolagenase). Aktivitas enzim dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
Asp – Abl 1 UA = x P x Ast – Abl T Dimana: \
A = Jumlah enzim yang menyebabkan perubahan 1 μmol substrat per menit pada suhu 37oC, pH 8,0
Asp = Absorbansi sampel Ast = Absorbansi standar Abl = Absorbansi blanko P = faktor pengenceran T = waktu inkubasi
(2) Analisis kadar protein (Bradford 1967)
Konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford. Persiapan pereaksi Bradford dilakukan dengan cara melarutkan 5 mg coomassie brilliant blue jenis G-250 dalam 2,5 ml etanol 95%, lalu ditambahkan dengan 5 ml asam fosfat 85% (w/v). Jika telah larut dengan sempurna, maka ditambahkan akuades hingga 250 ml dan disaring dengan kertas saring Whatman#1 dan diencerkan 5 kali sesaat sebelum digunakan.
Konsentrasi protein ditentukan dengan cara, sebanyak 0,1 ml sampel (larutan enzim) dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan sebanyak 5 ml pereaksi Bradford, diinkubasi selama lima menit dan diukur absorbannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.
Larutan standar segar dibuat menggunakan protein bovine serum albumin (BSA). Sebanyak 100 mg BSA ditimbang dan ditambahkan 25 ml akuades. Larutan kemudian dikocok pelan-pelan, setelah larut, diencerkan sampai 50 ml. Konsentrasi akhir larutan stock untuk standar ini adalah 2 mg/ml. Kemudian sederetan larutan standar dibuat menggunakan larutan stock di atas dengan cara mengencerkan larutan stok sehingga konsentrasinya 0,01-0,3 mg/ml. Absorban standar dan blanko (akuades) ditentukan dengan cara yang sama pada penentuan absorban sampel.
26
Tahap terakhir membuat kurva standar dengan absorbansi sebagai ordinat (sumbu Y) dan konsentrasi protein sebagai absis (sumbu X). Berdasarkan kurva tersebut dapat ditentukan konsentrasi protein dalam sampel. Hubungan antara konsentrasi larutan standar dan serapannya (absorbansi) dinyatakan sebagai persamaan regresi linear: Y=a+bx, dimana y=serapan (absorbansi); x=konsentrasi standar (mg/ml); a=interscept dan b=slope. Komposisi volume larutan pada pembuatan larutan standar dengan konsentrasi 0,01-0,3 mg/ml dari larutan stok BSA konsentrasi 2 mg/ml disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4 Pembuatan larutan standar BSA.
Konsentrasi BSA (mg/ml) Volume BSA (ml) Volume aquades (ml)
0 0 10,00 0,01 0,06 9,94 0,02 0,10 9,90 0,03 0,15 9,85 0,04 0,20 9,80 0,05 0,25 9,75 0,06 0,30 9,70 0,08 0,40 9,60 0,10 0,60 9,40 0,20 0,10 9,00 0,30 1,50 8,50
(3) Penentuan berat molekul
Berat molekul ditentukan menggunakan gel elektroforesis SDS-PAGE. Marker adalah standar protein berat molekul rendah (LMW) yaitu BSA (bovine serum albumin) (66,0 kDa), carbonic anhydrous (29,0 kDa), cytochromC (12,4 kDa) dan aprotinin (6,5 kDa). Gel terdiri dari dua jenis, yaitu 10% gel pemisah dan 4% gel penahan. Komposisi gel poliakrilamid disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5 Komposisi gel penahan dan gel pemisah. Nama bahan Gel penahan (4%) Gel pemisah (10%) Akrilamid 30% 0,5 ml- 3,34
Buffer gel pemisah 1,26 ml 1,25 Buffer gel pengumpul - -
SDS - - Substrat kolagen (0,25%) - - TEMED 0,005 ml 0,005 APS 0,05 ml 0,05
Konsentrasi akrilamid yang digunakan dalam analisis ini adalah 10% (w/v). Deteksi SDS-PAGE dilakukan dengan melepaskan gel hasil elektroforesis dari cetakan dan diukur jarak migrasi bromphenol blue. Gel tersebut dicelup dan direndam dalam larutan fiksasi (25% methanol+12% asam asetat) selama 1 jam sambil digoyang konstan. Kemudian direndam dalam 50% (v/v) etanol selama 20 menit, kemudian diganti dengan 30% (v/v) etanol selama 2x20 menit. Larutannya diganti dengan pengembang kemudian dicuci dengan akuabidestilata. Setelah dicuci ditambahkan larutan perak nitrat (AgNO3) 0,1% selama 30 menit kemudian dicuci lagi dengan akuabidestilata 2x20 detik dan ditambahkan larutan campuran Na2CO3 dan formaldehida dan terakhir dengan larutan fiksasi.
