Ekstraksi adalah proses pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan kelarutannya terhadap dua cairan tidak saling larut yang berbeda, biasanya air dan yang lainnya pelarut organik. Metode ekstraksi enzim pada perinsipnya mempertimbangkan beberapa hal, diantaranya adalah: sumber enzim, jenis, sifat serta bentuk ekstrak atau preparat yang diinginkan. Enzim-enzim hewan pada umumnya terletak pada organ-organ khusus seperti organ pencernaan dan jaringan. Ekstraksi enzim dari organ tersebut dilakukan dengan cara memisahkan enzim kasar dari lemak kemudian dihancurkan dengan pengontrolan suhu sehingga tidak terjadi denaturasi protein enzim (Suhartono 1989).
Pemisahan berbagai partikel non enzim yang tercampur dengan enzim dapat dilakukan dengan pengendapan partikel tersebut tanpa menggumpalkan enzim. Tahap ini disebut klarifikasi. Penambahan senyawa dapat membantu mempermudah penggumpalkan partikel non enzim. Contoh senyawa tersebut adalah ammonium sulfat, asam askorbat, garam-garam kalsium, serat selulosa, sistein, tanah diatome, gelatin, asam fosfat, garam Na fosfat, Na sulfat, dan Na sitrat (Suhartono 1989).
14
Apabila diinginkan produk enzim yang lebih murni, sebelum pengeringan, dilakukan penggumpalan enzim terlebih dahulu. Tahap ini disebut presipitasi. Tahap ini dapat dilakukan dengan dua jenis metode kimiawi, yaitu penambahan pelarut organik dan garam. Penambahan pelarut organik dapat menurunkan konstanta dielektrik dan menyebabkan medium kurang cocok untuk permukaan enzim yang polar. Ion garam seperti ion dari garam ammonium sulfat, yaitu ion NH4+ dan SO42- yang ditambahkan mempengaruhi kelarutan protein. Pada konsentrasi rendah, ion-ion garam tersebut akan melingkungi molekul protein dan mencegah bersatunya molekul-molekul ini, sehingga protein melarut. Peristiwa ini disebut salting in. Pada konsentrasi tinggi, terjadi peningkatan muatan listrik disekitar protein, yang akan menarik mantel air dari koloid protein. Interaksi hidrofobik diantara sesama molekul protein pada suasana ionik yang tinggi akan menurunkan kelarutan protein. Peristiwa ini disebut salting out (Suhartono 1989).
Proses pemurnian enzim dapat dilakukan menggunakan metode kromatografi dan elektroforesis. Kromatografi didefinisikan sebagai sistem pengaliran suatu fluida melalui kolom yang mengandung matriks bahan pengisi dan substanta yang ingin dipisahkan menjadi beberapa komponen dengan adanya perbedaan daya ikat terhadap bahan pengisi. Harris dan Angel (1989) membagi metode kromatografi menjadi empat kelompok, yaitu:
a. kromatografi adsorbsi yang bekerja berdasarkan perbedaan polaritas komponen sampel;
b. kromatografi penukar ion untuk melakukan pemisahan berdasarkan perbedaan jenis muatan adsorben dan komponen sampel;
c. kromatografi filtrasi gel yang memisahkan molekul berdasarkan ukurannya; d. kromatografi afinitas yang memisahkan komponen sampel berdasarkan
interaksi biokimia antara sampel dengan ligan yang terlibat pada matriks adsorban.
Mekanisme kromatografi penukar ion disajikan pada Gambar 7 dan gel filtrasi disajikan pada Gambar 8.
Gambar 7 Mekanisme kromatografi penukar ion (1) media kromatografi sebagai fase diam, mengandung resin bermuatan (+) di dalam kolom dialiri buffer, (2) larutan molekul yang bermuatan (+), (-), dan tidak bermuatan dialiri ke media, (3) molekul yang bermuatan berlawanan berikatan dengan resin, (4) dielusi dengan buffer, atau larutan yang mempunyai kekuatan ionik tertentu (fase bergerak), (5) buffer akan mengganti sampel yang bermuatan untuk berikatan dengan media (fase diam). Sumber: Boyer (1993).
Gambar 8 Mekanisme kromatografi gel filtrasi (A) Sampel terdiri dari molekul besar dan kecil, (B) Molekul yang besar tidak terperangkap dalam matriks gel sehingga keluar dari kolom lebih cepat, (C) Pengelusian molekul-molekul sampel. Sumber: Boyer (1993).
Media yang digunakan dalam memisahkan molekul-molekul yang berbeda ukurannya pada kromatografi gel filtarasi adalah dekstran yang telah mengalami reaksi cross linkage dengan bantuan epikhlorhidrin. Hasilnya adalah dekstran yang tidak larut air, tetapi dapat menyerap air dalam molekulnya sendiri. Daya serap tergantung pada jumlah cross linkage atau ikatan silang yang terjadi. Makin banyak ikatan silang, maka daya serapnya kurang baik (Scopes 1982; Harris & Angal 1989).
Dekstran bersifat hidrofilik, karena akan membentuk partikel gel hidrofilik. Istilah yang terkenal adalah sephadex. Sifat-sifatnya adalah tahan terhadap garam atau basa pada konsentrasi yang tinggi, tetapi rusak oleh asam (pH<2) dan oleh oksidator kuat. Sifat-sifat sephadex tersebut dikembangkan (swelling) dengan air. Nomor belakang menunjukkan besarnya pengembangan. Misalnya 100, berarti pengembangannya 100 kali setelah direndam dalam air. Tipe matriks kolom dan fraksinya disajikan pada Tabel 2.
16
Tabel 2 Tipe matriks kolom jenis dextran (Sephadex) dan kisaran fraksinasinya. Tipe Kisaran fraksinasi Air yang diserap
(g/g gel kering)
Volume kolom gel (mg/g gel kering) G10 Sampai 700 1,0 2 G15 Sampai 1500 1,5 3 G25 1000-5000 2,5 5 G50 1500–30000 5,0 10 G75 3000–80000 7,5 12 – 15 G100 4000–150000 10,0 15 – 20 G150 5000–400000 15,0 20 – 30 G200 5000–800000 20,0 30 - 40 Sumber: Scopes (1982). 2.7 Elektroforesis
Protein dapat dipisahkan satu dari yang lain oleh elektroforesis berdasarkan tanda dan jumlah muatan listrik pada gugus R dan gugus terminal amino dan terminal karboksil yang bermuatan. Seperti peptida sederhana, rantai polipeptida protein, mempunyai titik isoelektrik yang khas, yang akan mencerminkan jumlah relatif gugus R asam dan basa. Pada setiap pH tertentu, suatu campuran protein akan mengandung beberapa gugus yang bermuatan total negatif, beberapa yang bermuatan total positif dan beberapa yang tidak bermuatan. Jika campuran ini ditempatkan dalam medan listrik, maka protein yang bermuatan positif akan bergerak menuju elektroda yang bermuatan negatif, serta protein yang bermuatan total negatif akan bergerak menuju elektroda positif., serta protein yang tidak bermuatan akan tinggal diam. Molekul protein dengan densitas muatan yang relatif lebih tinggi akan bergerak menuju elektroda secara lebih cepat dibandingkan dengan protein dengan densitas muatan yang lebih rendah (Lehninger 1993).
Detergen sodium dodesil sulfat (SDS) bereaksi dengan protein mengakibatkan protein bermuatan negatif. Ketika dipisahkan dengan gel poliakrilamid maka metode pemisahan protein ini disebut sebagai Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Poliakrilamid terbentuk dari polimerisasi oleh akrilamid dan N,N’-metilen diamine bis akrilamid. Bis adalah ikatan silang pembentuk gel. Proses polimerisasi ini dikatalisasi oleh ammonium persulfat dan katalisator N,N,N,N’, tetra metilen diamin (TEMED). Gel menjadi netral, hidrofilik, membentuk matriks tiga dimensi
dengan ikatan silang hidrokarbon yang panjang kelompok methylen (Heidcamp 1995). Gambar 9 menunjukkan reaksi pembentukan gel poliakrilamide.
Gambar 9 Reaksi pembentukan gel poliakrilamide. Sumber: Heidcamp (1995)
Berat molekul protein dapat ditentukan dengan menggunakan protein baku yang telah diketahui berat molekulnya dan membandingkan nilai Rf (mobilitas relatif) yang diperoleh. Band atau pita berwarna dapat diketahui dengan reaksi pewarnaan seperti, pewarnaan, dengan coommasie blue. Elektrogram yang dihasilkan oleh metode elektroforesis dapat segera dikuantitatifkan dengan alat densitometer (Suhartono 1989).
