Lampiran 1. Penentuan konsentrasi pada penelitian pendahuluan dan penelitian inti
a. Penelitian pendahuluan Uji nilai kisaran
Menggunakan metode logaritmik berbasis 10 yaitu: A : Kontrol
B : 0.01 mg/l Hg (N03)2 dengan kandungan Hg (0.006 mg Hg/l)
C : 0.1 mg/l Hg (N03)2 dengan kandungan Hg (0.06 mg Hg/l)
D : 1 mg/l Hg (N03)2 dengan kandungan Hg (0.6 mg Hg/l)
E : 10 mg/l Hg (N03)2 dengan kandungan Hg (6 mg Hg/l) Uji toksisitas akut
A : Kontrol B : 0.178 mg/l Hg (N03)2 dengan kandungan Hg (0.110 mg Hg/l) C : 0.316 mg/l Hg (N03)2 dengan kandungan Hg (0.195 mg Hg/l) D : 0.562 mg/l Hg (N03)2 dengan kandungan Hg (0.347 mg Hg/l) E : 1 mg/l Hg (N03)2 dengan kandungan Hg (0.618 mg Hg/l) b. Penelitian inti
Pada penelitian inti digunakan konsentrasi merkuri yang sama yaitu 10 % dari LC50 96 jam yaitu 0.02 mg/l Hg (N03)2 dengan kandungan Hg (0.012 mg
Lampiran 2. Metode pengenceran salinitas
Untuk mendapatkan media salinitas 10 ppt dan volume air yang dikehendaki 150 liter dengan air laut yang tersedia kadar salinitasnya 30 ppt, maka air laut yang diperlukan sebanyak 50 liter air laut dan air tawar sebanyak 100 liter. 30 10 10/30 x 150 liter = 50 liter (Air laut) 10 0 20 20/30 x 150 liter = 100 liter (Air tawar)
Lampiran 3. Prosedur pengamatan tingkat kerja osmotik atau gradien osmotik 1. Nyalakan main power (terletak dibelakang dekat kabel main power)
2. Posisi handle sampel di atas
3. Alat akan melakukan prosedur pemanasan dengan indikasi lampu spontcryst result dan no cryst menyala secara bergantian. Tunggu sampai mati hanya lampu sampel yang menyala.
4. Zero set:
a. Siapkan akuades dan masukkan ± 50 µm dalam tabung sampel, masukkan ke sensor.
b. Tekan tombol zero sampai keluar angka 0.000
c. Turunkan handle sampel tunggu sampai display 0.000 dan lampu result menyala
d. Angkat handle
e. Bilas sensor dengan akuades dan bersihkan dengan tissue
5. Kalibrasi:
a. Siapkan cairan standar kalibrasi dan masukkan ± 50 µm dalam tabung sampel dan masukkan ke sensor.
b. Tekan tombol Cal sampai keluar angka 0.300
c. Turunkan handle sampel tunggu sampai display 0.300 dan lampu result menyala
d. Angkat handle
e. Bilas sensor dengan menggunakan akuades dan bersihkan dengan tissue
6. Sampel:
a. Siapkan cairan sampel dan masukkan ± 50 µm dalam tabung sampel dan masukkan ke sensor.
b. Tekan tombol sampel
c. Turunkan handle sampel tunggu sampai pengukuran selesai dan lampu resultnya menyala
d. Angkat handle
e. Bilas sensor dengan menggunakan akuades dan bersihkan dengan tissue
7. Setelah selesai melakukan pengukuran:
a. Bersihkan sensor menggunakan tissue yang dibasahi akuades
b. Pada saat tidak digunakan sensor harus ditutup dengan tabung kososng (handle dalam posisi turun)
c. Matikan main power: OFF
Lampiran 4. Prosedur pengamatan kondisi hematologi a. Pengamatan haemoglobin
pengamatan dilakukan menggunakan metode sahli dengan sahlinometer atas dasar konversi haemoglobin darah ke dalam bentuk asam hematin oleh asam klorida. Darah dihisap dengan menggunakan pipet sahli sampai 20 mm3 kemudian ujungnya dibersihkan dari sisa-sisa darah dengan kertas penyerap. Selanjutnya darah dipindahkan ke dalam tabung HBmeter yang telah diisi dengan HCl 0,1 N sebanyak 10 mm3. Kemudian kedua bahan tersebut dibiarkan selama 3-5 menit agar haemoglobin bereaksi dengan HCl untuk membentuk asam hematin. Selanjutnya sambil diaduk ditambahkan akuades sedikit demi sedikit sampai warna cairan dalam tabung sahli sama dengan warna standar. Pembacaan skala dilakukan dengan melihat tinggi permukaan larutan dan dicocokkan dengan skala lajur gram % yang menunjukkan Hb dalam gram setiap 100 ml darah (%Hb). b. Pengamatan Hematokrit
Kadar hematokrit diukur dengan metode Anderson dan Siwichki (1993). Darah dihisap dengan menggunakan tabung mikrohematokrit berlapis yang berfungsi untuk mencegah pembekuan darah dalam tabung, sampai volume darah mancapai ¾ bagian tabung kemudian salah satu ujung tabung disumbat dengan kristosel. Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Pengukuran kadar hematokrit dilakukan dengan membandingkan volume darah yang mengendap dengan volume seluruh darah menggunakan skala hematokrit dan dinyatakan dalam persentase hemtokrit (%Ht).
c. Pengamatan jumlah eritrosit
Sampel darah diencerkan dengan larutan Hayem untuk mengahancurkan sel darah putih agar jumlah sel darah merah dapat dihitung. Pengenceran dilakukan dengan menggunakan pipet pencampur berskala maksimum 11 yang dilengkapi pengaduk. Darah dihisap dengan pipet hingga skala 1, kemudian dihisap larutan hayem hingga skala 11 dengan pipet yang sama. Pipet digoyang selama 15 menit agar darah tercampur secara merata, sedangkan larutan pada ujung pipet yang tidak tercampur segera dibuang. Darah yang teraduk diteteskan kedalam hemositometer yang dilengkapi gelas penutup hingga memenuhi seluruh
permukaan yang berskala, selanjutnya dilakukan penghitungan dibawah mikroskop.
d. Pengamatan jumlah leukosit
Sampel darah diencerkan dengan larutan Turks untuk menghancurkan sel darah merah agar jumlah sel darah putih dapat dihitung. Untuk mengencerkan leukosit digunakan pipet berskala maksimal 11 yang dilengkapi batang pengaduk. Sebelumnya darah dihisap hingga skala 1, kemudian dilanjutkan dengan menghisap larutan Turks hingga skala 11. Pencampuran dilakukan dengan mengaduk pipet selama 15 menit agar darah tercampur secara merata. Setelah pencampuran selesai, larutan diteteskan kedalam hemositometer yang dilengkapi gelas penutup hingga memenuhi seluruh permukaan yang berskala, selanjutnya dilakukan penghitungan leukosit di bawah mikroskop.
Lampiran 5. Prosedur pembuatan preparat histokimia
Prosedur kerja dalam pembuatan preparat histokimia adalah: 1. Pengambilan sampel (sampling)
Pengambilan insang dan hati dari dalam tubuh ikan bandeng dilakukan dengan menggunakan pisau yang tajam dan selanjutnya dijadikan preparat. Potongan tersebut dicuci bersih dengan menggunakan larutan NaCl fisiologis dan selanjutnya diawetkan dalam larutan Bouin sebagai pengawet dan dimasukkan kedalam botol sampel.
2. Pengawetan (Fiksasi)
Proses pengawetan dilakukan untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan post mortem (pasca mati) pada jaringan, menjaga agar bagian padat dan bagian cair protoplasma sel tetap terpisah, merubah bagian-bagian sel agar menjadi bahan-bahan yang tidak larut pada proses berikutnya. Melindungi sel dari proses pengerutan saat dimasukkan ke dalam alkohol atau paraffin panas serta meningkatkan kemampuan dari tiap-tiap bagian jaringan agar dapat diwarnai serta meningkatkan indeks refraksi jaringan sehingga visibilitasnya naik.
Larutan fiksasi yang baik dapat melakukan penetrasi secara cepat untuk mencegah terjadinya perubahan pasca mati, mengkoagulasi substansi-substansi sel menjadi substansi yang tidak larut, melindungi jaringan dari pengerutan dan kerusakan baik pada saat dehidrasi, embedding, maupun pada saat pemotongan serta memudahkan pewarnaan bagian-bagian sel. Pada penelitian ini larutan pengawet yang digunakan adalah larutan pengawet Bouin.
Organ yang difiksasi selama 24 jam dalam larutan Bouin selanjutnya dicuci dalam alkohol 70 %. Pencucian ini dimaksudkan agar dapat menghilangkan sisa bahan pengawet yang terdapat dalam jaringan yang dapat mengganggu proses preparasi selanjutnya. Organ yang telah dicuci kemudian disimpan dalam alkohol 70 % sebelum proses selanjutnya.
3. Proses penghilangan air (dehidrasi)
Proses ini merupakan proses penarikan air dari jaringan yang dilakukan dengan merendam jaringan ke dalam alkohol secara bertingkat mulai dari alkohol 80 %, 90 %, 95 % sampai ke alkohol absolut. Penggunaan alkohol bertingkat ditujukan untuk menarik air dan dapat mencegah terjadinya pengerutan.
4. Proses penjernihan (Clearing)
Untuk menghilangkan pengaruh alkohol yang terdapat di dalam jaringan, maka selanjutnya jaringan tersebut direndam dengan Xylol. Setelah dilakukan proses penjernihan maka jaringan akan lebih transparan dan berwarna lebih tua. 5 Proses Infiltrasi (Infiltring)
Jaringan yang telah mengalami proses penjernihan selanjutnya direndam ke dalam paraffin secara bertingkat pada suhu 60 0C (paraffin keras). Penggunaan paraffin keras agar dapat dilakukan pemotongan yang tipis.
6. Proses penanaman (Embedding)
Proses ini harus dilakukan di dekat Bunsen dimana seluruh alat-alat yang digunakan harus dalam keadaan hangat untuk mencegah agar paraffin tidak mengeras sebelum pekerjaan selesai. Peletakan jaringan di dalam wadah harus sedemikian rupa sehingga memudahkan pada saat pemotongan dan pengenalan kembali jaringan. Wadah yang telah berisi jaringan bercampur dengan paraffin didinginkan untuk mengeraskan parafinnya. Blok yang sudah mengeras kemudian diletakkan pada blok kayu untuk disimpan dalam kulkas minimal 6 jam sebelum dipotong.
7. Proses pemotongan blok jaringan
Blok jaringan dipotong dengan menggunakan mikrotom. Ketebalan jaringan ditetapkan setebal 5 mikron. Hasil sayatan diapungkan terlebih dahulu pada air hangat (40 0C), lalu diletakkan diatas gelas obyek. Selanjutnya gelas obyek diletakkan di atas hotplate selama 10 sampai 15 menit sampai seluruh air yang berada diantara jaringan dan gelas obyek menguap. Gelas obyek disimpan di dalam incubator (37 0C – 40 0C) selama satu malam sebelum digunakan pada proses selanjutnya.
8. Proses pewarnaan
Untuk melihat akumulasi merkuri pada jaringan insang dan hati dilakukan pewarnaan logam berat dengan prosedur sebagai berikut:
Objek glass dimasukkan kedalam akuades
50 mg Haemotoxylin dimasukkan ke dalam 1 ml ethanol absolut. Selanjutnya dimasukkan ke dalam 99 ml deionized water.
Kemudian irisan dalam objek glass diwarnai dengan larutan Haemotoxylin tersebut dan dibiarkan selama 2 jam.
Selanjutnya objek glass dimasukkan ke dalam ethanol 95 % dan berikutnya ke dalam ethanol absolut sebanyak 2 kali.
Dilakukan penjernihan dengan xylene
Preparat diberi perekat dengan menggunakan kanada balsam, lalu ditutup dengan kaca penutup, dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Preparat selanjutnya diberi label sesuai dengan perlakuan
Lampiran 6. Prosedur pengukuran kadar glukosa darah
Prosedur pengukuran glukosa darah ikan yaitu darah diambil dari ikan dengan menggunakan injeksi yang telah di isi dengan cairan antikoagulan untuk mencegah terjadinya penggumpalan darah. Darah yang tersedot dimasukkan ke dalam tabung ependorf, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Setelah itu akan terbentuk lapisan-lapisan yang terdiri dari lapisan plasma yang jernih di bagian atas. Selanjutnya diambil sebanyak 10 µl lapisan plasma dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 1 ml reagen (glucose liquicolor). Kemudian divortex agar homogeny dan setelah itu diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Terakhir dibaca nilai absorbannya pada spektrofotometer dengan λ 500 nm.
Lampiran 7. Prosedur pengukuran kadar merkuri dengan AAS
Spektrofotometer serapan atom (AAS) adalah salah satu teknik analisis unsur yang dapat dilakukan dengan cepat serta mempunyai tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Prinsip dasar analisis AAS adalah jika suatu contoh diaspirasikan ke dalam suatu sistem pembakaran, maka unsur-unsur yang ada pada senyawaan akan dikonversi menjadi atom. Apabila pada kondisi ini diberikan suatu energi radiasi yang sesuai maka energi tersebut akan diserap oleh atom. Besar kecilnya energi yang diserap akan berbanding lurus dengan konsentrasi unsur yang dianalisis.
Destruksi basah:
Timbang 1 gram contoh, masukkan ke dalam labu destruksi 100 ml, tambahkan 15 ml HNO3 pekat dan 5 ml HClO4. Kemudian biarkan semalam.
Selanjutnya didestruksi sampel jernih, dinginkan dan tambahkan 10-20 ml air bebas ion. Lanjutkan pemanasan ± 10 menit, angkat dan dinginkan. Larutan tadi dipindahkan ke dalam labu takar 100 ml (bilas labu destruksi dengan air bebas ion dan masukkan ke dalam labu takar). Larutan ditambah air sampai tanda tera. Kemudian kocok dan saring dengan kertas saring Whatman no. 41 kemudian filtrate siap dianalisis.
Preparasi reagen:
1. Larutan SnCl2 (pereduksi)
Timbang 20 gram SnCl2.2H2O masukkan ke dalam labu takar 200 ml, lalu
tambahkan 40 ml HCl (p). Tera dengan akuades.
2. Larutan H2SO4 1 N (blanko)
Dipipet 5.5 ml H2SO4 98 %, masukkan ke dalam labu takar 200 ml. Tera
dengan akuades.
3. Larutan penyerap merkuri (buangan) adalah KMnO4 0.5 % dan H2SO4 5 %.
Ditimbang 5 gram KMnO4 + 51 ml H2SO4 98 %, masukkan ke dalam labu
takar 1000 ml. Tera dengan akuades. 4. Standar Merkuri (Hg)
Siapkan deret standar Hg (missal: 2, 4, dan 6 ppb)
Dipipet 0.4 µl standar Hg 1000 ppm + 5.5 ml H2SO4 98 %, masukkan ke dalam
Pengukuran:
1. Letakkan absorption cell pada burner head AAS 2. Siapkan larutan buangan
3. Isi pipa U dengan MgCl2
4. Setting MVU pada mode Circular-Close 5. Posisi switch power OFF > exhaust Measure
6. Siapkan larutan blanko dalam wadah reaksi + batang magnet 7. Atur switch power ON > speed magnetic stirrer
8. Masukkan larutan 5 ml SnCl2 (berlebih)
9. Tunggu sampai absorban stabil > klik Blank pada layar WizAArd AAS 10. Atur exhaust clear > tunggu sampai absorban mendekati nol
11. Atur posisi power OFF
12. Ganti wadah reaksi dengan larutan berikutnya. Ulangi langkah no. 4 – 9 Note : blanko > Blank
Standar > start Sampel > start
