HASIL DAN PEMBAHASAN Identifikasi Tanaman

Tanaman alamanda pada sampel penelitian ini diambil dari 4 daerah di Bogor, yaitu Cikabayan, Cisarua, Cipanas, dan Cibirus. Sampel alamanda dari Cikabayan terdiri atas dua jenis :Cikabayan 1 dan Cikabayan 2. Identifikasi spesies sampel dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bogor. Tanaman alamanda diketahui memiliki banyak spesies, diantaranya A. cathartica, A. Schottii, A. hendersoni, A. blanchetti, dan A. neriifolia

(Heyne 1987). Hasil identifikasi dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1 Hasil identifikasi sampel Daerah Spesies Cikabayan 1 Allamanda schottii Cikabayan 2 Allamanda cathartica Cisarua Allamanda schottii Cipanas Allamanda schottii Cibirus Allamanda cathartica

Hasil identifikasi menunjukkan bahwa terdapat 2 spesies tanaman alamanda dari 5 sampel yang ada, yaitu A. schottii dan A. cathartica. Tanaman A. cathartica dapat berbunga sepanjang tahun, namun A. schottii

hanya berbunga pada bulan Maret–Agustus di pulau Jawa (PROSEA 2002). Perbedaan keduanya terlihat dari besar kecilnya bunga.

A. cathartica memiliki bunga yang besar dan lebar, sedangkan A. schottii berbunga kecil dan tidak terlalu mekar seperti halnya bunga terompet (Gambar 1).

Kadar Air dan Kadar Abu

Kadar air dari setiap sampel ditentukan untuk mengetahui ketahanan sampel terhadap penyimpanan. Kadar abu juga ditentukan untuk mengetahui kandungan mineral yang terdapat dalam setiap sampel.

Kadar abu yang diperoleh berkisar 2-9% (Tabel 2). Kadar abu tertinggi diperoleh pada sampel daun Cisarua yaitu sebesar 9.50%. Tingginya kadar abu suatu bahan mengindikasikan tingginya kandungan bahan anorganik dalam bahan tersebut. Kadar abu menurut Patria (2007) berhubungan dengan kemurnian bahan yang dihasilkan.

Tabel 2 Kadar air dan abu alamanda^(a) Daerah Sampel ^{Kadar (%)}

Air Abu A. schottii Cikabayan 1 Daun 9.19 7.67 Batang 5.88 2.79 Cipanas Daun 8.63 7.02 Batang 5.80 5.69 Bunga 12.02 5.36 Cisarua Daun 9.20 9.50 Batang 5.60 8.21 A. cathartica Cikabayan 2 Daun 4.97 7.75 Batang 6.03 3.74 Bunga 14.25 4.36 Cibirus Daun 8.42 7.10 Batang 6.77 4.01 Bunga 10.34 6.19 Keterangan: (a) contoh perhitungan kadar air dan abu

ditunjukkan pada Lampiran 2 dan 3.

Setiap bagian sampel yang diuji dalam penelitian ini, secara umum memiliki kadar air <10%, kecuali bagian bunga (Tabel 2). Winarno (1997) menyatakan bahwa sampel dengan kadar air <10% memiliki ketahanan penyimpanan yang relatif lebih lama dan dapat terhindar dari kerusakan yang diakibatkan oleh mikrob. Daun pada setiap sampel memiliki rataan kadar air sekitar 9%, sedangkan bagian batangnya berkisar 5–6%. Kadar air simplisia tidak boleh >10% (Depkes RI 1995). Karena itu bagian daun dan batang setiap sampel alamanda sudah memenuhi

positif juga diuji pada variasi konsentrasi yang sama dalam pelat tetes 96 sumur. Ekstrak sampel masing-masing ditambahkan sebanyak

70 μL ke dalam pelat tetes 96 sumur. Kemudian ke dalam tiap sumur ditambahkan

30 μL enzim tirosinase (Sigma, 333 unit/ml dalam bufer fosfat) dan campuran diinkubasi selama 5 menit. Setelah itu, sebanyak 110 μL substrat (L-tirosin 2 mM atau L-DOPA 12 mM) ditambahkan dan campurannya diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 30 menit. Larutan pada masing-masing sumur diukur absorbansnya dengan menggunakan micro-plate reader pada panjang gelombang 492 nm untuk menentukan persen inhibisi dan nilai konsentrasi hambat 50% (IC50). Persen inhibisi dihitung dengan cara membandingkan absorbans sampel tanpa penambahan ekstrak (A) dan dengan penambahan ekstrak (B) pada panjang gelombang 492 nm.

Inhibisi =

^ 100%

A

B

A

HASIL DAN PEMBAHASAN

Identifikasi Tanaman

(Heyne 1987). Hasil identifikasi dapat dilihat pada Tabel 1.

hanya berbunga pada bulan Maret–Agustus di pulau Jawa (PROSEA 2002). Perbedaan keduanya terlihat dari besar kecilnya bunga.

A. cathartica memiliki bunga yang besar dan lebar, sedangkan A. schottii berbunga kecil dan tidak terlalu mekar seperti halnya bunga terompet (Gambar 1).

Kadar Air dan Kadar Abu

Kadar air dari setiap sampel ditentukan untuk mengetahui ketahanan sampel terhadap penyimpanan. Kadar abu juga ditentukan untuk mengetahui kandungan mineral yang terdapat dalam setiap sampel.

Tabel 2 Kadar air dan abu alamanda^(a) Daerah Sampel ^{Kadar (%)}

ditunjukkan pada Lampiran 2 dan 3.

standar kadar air simplisia, sedangkan bagian bunga pada setiap sampel belum memenuhi standar. Tingginya kadar air suatu bahan dapat disebabkan oleh kurangnya proses pengeringan dan mudahnya bahan tersebut dalam menyerap air setelah proses pengeringan. Kelembapan tempat penyimpanan sampel juga berpengaruh besar terhadap kandungan air pada sampel tersebut. Sampel setelah pengeringan seharusnya disimpan dalam tempat yang kedap udara dan tidak lembap agar kandungan air dalam sampel tersebut tidak bertambah.

Ekstraksi

Ekstraksi suatu sampel dinyatakan efektif apabila banyak senyawa terambil dalam pelarut yang digunakan. Banyaknya senyawa yang terekstraksi dalam pelarut dapat ditentukan dengan melihat persen rendemen yang diperoleh. Rendemen ekstrak air dan metanol sampel alamanda diberikan pada Tabel 3. Terlihat bahwa rendemen ekstrak air maupun metanol pada bagian bunga tertinggi untuk semua sampel, diikuti bertutur-turut oleh bagian daun dan bagian batang. Sebagian besar ekstrak air sampel memiliki rendemen yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak metanolnya.

Tabel 3 Rendemen ekstrak air dan metanol alamanda^(a)

Sampel Bagian Rendemen ekstrak (%) Air Metanol A. schottii Cikabayan1 Daun 31.36 30.76 Batang 14.22 11.98 Cipanas Daun 20.70 28.14 Batang 5.89 15.74 Bunga 63.54 44.37 Cisarua Daun 19.76 14.03 Batang 13.38 17.46 A. cathartica Cibirus Daun 17.99 20.41 Batang 6.83 6.84 Bunga 33.34 32.06 Cikabayan 2 Daun 29.46 23.95 Batang 7.74 7.12 Bunga 35.75 46.55 Keterangan: (a) Contoh perhitungan rendemen ditunjukkan

pada Lampiran 4 dan 5.

Fitokimia

Uji fitokimia bertujuan mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder yang terdapat di dalam ekstrak. Hasil uji fitokimia ekstrak air dan metanol dapat dilihat pada Tabel 4.

Hasil pengujian untuk flavonoid dan fenol pada ekstrak air maupun metanol tidak berbeda jauh. Senyawa fenolik seperti flavonoid cenderung mudah larut di dalam air karena sering berikatan dengan gula sebagai glikosida (Harborne 1987).

Hasil pengujian fitokimia tidak terlalu berbeda signifikan antara ekstrak air dan metanol dari ekstrak tanaman A. schottii. Ekstrak air A. schottii yang mengandung senyawa flavonoid adalah ekstrak daun, batang, dan bunga untuk sampel dari Cipanas, ekstrak daun dan batang untuk sampel dari Cikabayan, dan ekstrak daun untuk sampel dari Cisarua. Pada ekstrak metanol, hanya ekstrak daun dari Cikabayan yang tidak terdeteksi mengandung senyawa flavonoid. Tanin dan fenol terdeteksi pada ekstrak air dan metanol daun A. schottii dari setiap daerah dan untuk sampel dari Cipanas, tanin dan fenol juga terdeteksi pada ekstrak bunganya.

Ekstrak air dan metanol A. cathartica

yang terdeteksi mengandung flavonoid adalah ekstrak daun, batang dan bunga untuk sampel dari Cibirus, sedangkan untuk sampel dari Cikabayan hanya terdeteksi pada ekstrak daun. Sementara tanin dan fenol terdeteksi padaekstrak daun dan juga bunga.

Golongan senyawa flavonoid yang diketahui terdapat di dalam tanaman alamanda diantaranya adalah isoflavon, flavonol (kaempferol dan kuersetin), dan flavanon (naringenin) (Schmidt et al. 2006). Banyak senyawa golongan flavonoid telah diketahui mempunyai aktivitas sebagai inhibitor tirosinase, diantaranya adalah golongan senyawa flavonol (kuersetin, kaempferol, dan mirisetin), flavon (noratokarpetin), flavanon (stepogenin), flavanol (dihidromorin dan taksifolin), isoflavan (gliasperin C, glabridin), kalkon, dan isoflavon (kalikosin) (Chang 2009).

Alkaloid merupakan golongan senyawa terbesar yang terdapat di dalam tumbuhan. Ekstrak air dan metanol setiap bagian sampel

A. cathartica dari setiap daerah, didapati mengandung senyawa alkaloid. Pada ekstrak air sampel A. schottii, alkaloid terdeteksi pada seluruh bagian tanaman dari setiap daerah, kecuali bagian batang A. schottii dari Cipanas,

sedangkan untuk ekstrak metanolnya, alkaloid hanya terdeteksi pada bagian bunga dan daun sampel dari Cipanas, batang sampel dari Cikaban, dan daun sampel dari Cisarua.

Saponin merupakan glikosida triterpena dan sterol yang memiliki sifat seperti sabun (Harborne 1987). Hasil uji kualitatif menunjukkan bahwa senyawa saponin diperoleh pada ekstrak metanol maupun air. Pada ekstrak air sampel A. cathartica saponin hanya terdeteksi pada bagian daun dan bunga untuk sampel dari Cikabayan, sedangkan untuk sampel dari Cibirus saponin terdeteksi pada bagian batang dan bunga.Pada ekstrak metanolnya, saponin terdeteksi pada bagian daun dan batang sampel dari Cikabayan dan bagian daun sampel dari Cibirus.

Saponin juga terkandung pada sampel A. Schottii. Pada ekstrak airnya, saponin terkandung pada bagian daun dan batang sampel dari Cikabayan, bagian bunga sampel dari Cipanas, dan bagian daun sampel dari Cisarua, sedangkan pada ekstrak metanolnya saponin terdeteksi pada bagian daun dan batang sampel dari Cikabayan, dan bagian daun dan bunga sampel dari Cipanas.

Terpenoid merupakan senyawa yang larut dalam lemak, umumnya terkandung dalam bentuk minyak atsiri. Metanol memiliki kepolaran yang lebih rendah daripada air sehingga dapat mengekstraksi senyawa yang bersifat non-polar. Oleh sebab itu, baik untuk ekstrak air A. schottii maupun A. cathartica

tidak terdeteksi senyawa terpenoid, sedangkan pada ekstrak metanol untuk beberapa bagian sampel terdeteksi mengandung terpenoid.

Untuk ekstrak metanol A. schottii, senyawa terpenoid hanya terdeteksi pada bagian batang dan bunga sampel dari Cipanas dan bagian batang untuk sampel dari Cisarua.Sementara ekstrak metanol A. cathartica yang terdeteksi mengandung terpenoid adalah bagian bunga untuk sampel Cikabayan dan bagian batang dan bunga untuk sampel dari Cibirus.

Kandungan senyawa steroid terdeteksi pada ekstrak air untuk beberapa sampel, sedangkan untuk ekstrak metanol hampir semua bagian tanaman dari setiap sampel mengandung steroid. Pada ekstrak air A. schottii, steroid terdeteksi pada bagian daun sampel dari Cikabayan, bagian daun, batang, dan bunga sampel dari Cipanas, dan bagian batang sampel dari Cisarua.Pada ekstrak metanolnya sendiri, steroid terdeteksi pada seluruh bagian sampel dari setiap daerah kecuali bagian bunga sampel dari Cipanas.

Ekstrak air sampel A. cathartica yang terdeteksi mengandung senyawa steroid adalah bagian bunga sampel dari Cikabayan dan bagian daun sampel dari Cibirus, sedangkan pada ekstrak metanolnya steroid terdeteksi pada bagian daun dan batang sampel dari Cikabayan dan bagian daun sampel dari Cibirus. Golongan senyawa steroid diketahui memiliki aktivitas sebagai inhibitor tirosinase (Chang 2009).

Perbedaan kandungan senyawa metabolit sekunder pada tanaman dengan spesies yang sama dapat disebabkan oleh perbedaan daerah tempat tanaman tersebut tumbuh. Hal yang memengaruhi hal tersebut diantaranya adalah kondisi lingkungan seperti kandungan hara Tabel 4 Hasil uji fitokimia ekstrak kasar air dan metanol alamanda

Sampel Bagian ^Fitokimia

A¹ A² B¹ B² C¹ C² D¹ D² E¹ E² F¹ F² G¹ G² A. schottii Cikabayan 1 Daun + - + - + + + + + + - - + + Batang + + + + + + - - - + Cipanas Daun + + ₊ + _- + ₊ + ₊ + - _- ₊ + Batang + + - - _- - _- - _- - - + + + Bunga + + + + + + _- + _- + - + + - Cisarua Daun + + + + ₊ - ₊ + ₊ + - - - + Batang - - + - _- - _- - _- - - + + + A. cathartica Cikabayan 2 Daun + + + + + + + + + + - - - + Batang - - + + - + - - - + Bunga - - + + + - + + + + - + + - Cibirus Daun + + + + _- + ₊ + ₊ + - - + + Batang + + + + ₊ - _- - _- - - + - - Bunga + + ₊ + ₊ - ₊ + ₊ + - ₊ _- - Keterangan: (1) ekstrak air, (2) ekstrak metanol, (A) flavonoid, (B) alkaloid, (C) saponin, (D) tanin,(E) fenol,(F) terpenoid, (G) steroid, (+) positif, dan (-) tidak terdeteksi.

dan mineral di dalam tanah tempat tanaman tersebut tumbuh.

Aktivitas Inhibitor Tirosinase Ekstrak Kasar

Penapisan aktivitas ekstrak kasar air maupun metanol sampel alamanda dilakukan untuk mengetahui ekstrak teraktif yang berfungsi sebagai inhibitor enzim tirosinase. Aktivitas inhibitor enzim tirosinase dilihat dari daya inhibisi terhadap monofenolase dan difenolase (Tabel 5). Ekstrak metanol yang aktif adalah daun dan batang A. schottii

Cipanas, daun dan batang A. schottii Cisarua, batang A. cathartica Cibirus dan daun A. cathartica Cikabayan. Untuk ekstrak air, yang aktif adalah daun dan batang A. schottii

Cipanas, daun A. cathartica Cibirus, daun A. schottii Cisarua, daun A. schottii Cikabayan, dan daun dan batang A. cathartica Cikabayan.

Spesies A. schottii memiliki aktivitas sebagai inhibitor enzim tirosinase baik yang berasal dari Cipanas, Cisarua, maupun Cikabayan. Ekstrak air dan metanol daun dan batang A. schottii dari Cipanas aktif menghambat aktivitas monofenolase maupun difenolase, sedangkan ekstrak bunganya tidak memiliki aktivitas sebagai inhibitor tirosinase. Ekstrak metanol bagian batang dan daun A. schottii dari Cisarua aktif menghambat aktivitas monofenolase, sedangkan pada ekstrak airnya yang aktif sebagai inhibitor

tirosinase hanya bagian daun dan aktif menghambat aktivitas monofenolase maupun difenolase. Sementara itu ekstrak A. schottii

dari Cikabayan yang aktif menghambat aktivitas monofenolase maupun difenolase hanya ekstrak air bagian daun.

Spesies A. cathartica juga memiliki aktivitas inhibitor tirosinase. A. cathartica dari Cikabayan baik ekstrak metanol maupun ekstrak air, bagian daun dan batangnya aktif sebagai inhibitor tirosinase. Bagian batangnya aktif menghambat aktivitas monofenolase dan difenolase, sedangkan bagian daunnya hanya aktif menghambat aktivitas monofenolase. A. cathartica dari Cibirus yang aktif sebagai inhibitor tirosinase adalah bagian batang untuk ekstrak metanol dan bagian daun untuk ekstrak air, keduanya sama-sama aktif menghambat aktivitas maupun difenolase. A. cathartica merupakan jenis alamanda yang diteliti oleh Yamauchi et al. (2010), dan dilaporkan mengandung senyawa aktif glabridin yang berfungsi sebagai inhibitor tirosinase.

Perbedaan aktivitas inhibitor tirosinase di antara satu spesies yang sama dapat disebabkan oleh perbedaan daerah asal sampel tersebut diambil. Sementara perbedaan aktivitas yang terjadi di antara sampel yang sama dengan pelarut yang berbeda dapat disebabkan oleh terbawanya senyawa lain dalam ekstrak yang menurunkan aktivitas inhibitor.

Tabel 5 IC50 ekstrak kasar air dan metanol sampel alamanda ^(a) Sampel Bagian

Monofenolase (μg/mL) Difenolase(μg/mL)

Ekstrak

metanol ^{Ekstrak air}

Ekstrak

metanol ^{Ekstrak air}

A. schottii Cikabayan 1 Daun - 107.49 - 927.80 Batang - - - - Cipanas Daun 417.89 80.75 292.39 112.04 Batang 703.14 190.30 1041.61 659.90 Bunga - - - - Cisarua Daun 163.14 809.79 - 361.65 Batang 278.70 - - - A. cathartica Cikabayan 2 Daun 363.81 187.32 - - Batang 872.99 140.45 385.15 774.52 Bunga - - - - Cibirus Daun - 93.13 - 1273.29 Batang 347.83 - 656.27 - Bunga - - - -

Asam kojat (kontrol

positif) 0.012 128.79

Keterangan:(-) tidak mencapai IC50hingga konsentrasi 2000 μg/mL, dan (a) contoh perhitungan diberikan padaLampiran 6.

Ekstrak air daun A. schottii Cipanas memiliki daya inhibisi tertinggi dengan nilai IC50 untuk aktivitas monofenolase sebesar 80.75 μg/mL dan 112.04 μg/mL untuk aktivitas difenolase, sedangkan kontrol positif berupa asam kojat memiliki nilai IC50 sebesar 0.012 μg/mL untuk aktivitas monofenolase dan 128.79 μg/mL untuk aktivitas difenolase. Aktivitas inhibitor enzim tirosinase ekstrak air Daun A. schottii dari Cipanas lebih rendah biladibandingkan dengan asam kojat.

Penentuan Eluen Terbaik

Ekstrak air daun A. schottii dari Cipanas yang telah dipartisi dengan etil asetat dielusi menggunakan 6 eluen tunggal, yang memiliki perbedaan kepolaran. Hasilnya ditunjukkan pada Gambar 3.

Gambar 3 Kromatogram eluen terbaik fraksi etil asetat ekstrak air

A. schottii Cipanas dengan pelarut tunggal metanol (a), aseton (b), etilasetat (c), kloroform (d), n -heksana (e), dan dietil eter (f). Diperoleh metanol sebagai pelarut terbaik dengan jumlah noda terbanyak, namun pemisahannya belum terlalu baik. Oleh sebab itu, digunakan 2 pelarut lainnya yang memiliki tingkat kepolaran berbeda dengan metanol agar noda-noda tersebut dapat terpisah dengan baik. Kedua pelarut tersebut adalah kloroform dan n-heksana. Kombinasi ketiga pelarut dirancang dengan menggunakan

simplex centroid design (SCD). Terdapat 10 kombinasi pelarut yang digunakan yaitu 1:0:0, 0:0:1, 0:1:0, 1/2:0:1/2, 0:1/2:1/2, 1/2:1/2:0, 1/3:1/3:1/3, 1/6:2/3:1/6, 1/6:1/6:2/3, dan 2/3:1/6:1/6. Eluen terbaik dipilih berdasarkan jumlah noda terbanyak dan keterpisahannya. Kombinasi pelarut Metanol : klorofom : n -heksana (1/6:2/3:1/6) dengan pemisahan 9 noda (Gambar 4) diperoleh sebagai eluen terbaik.

Gambar 4 Kromatogram eluen terbaik metanol : kloroform : n -heksana (1/6:2/3:1/6).

Fraksionasi dengan Kolom Kromatografi Fraksionasi fraksi etil asetat ekstrak air daun A. schottii Cipanas dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom (Gambar 5). Digunakan fase diam silika gel dan fase gerak berupa gradien dari eluen terbaik.

Gambar 5 Kolom kromatografi fraksi etil asetat ekstrak air daun

A. schottii Cipanas pada fase diam silika gel.

Fraksionasi dengan kromatografi kolom ini dilakukan secara step-gradient. Eluen dialirkan berdasarkan peningkatan kepolaran dimulai dari n-heksana, klorofom dan kemudian metanol. Hasil pemisahan dengan kolom kromatografi ini diperoleh 9 fraksi. Kromatogram dari 9 fraksi hasil kolom dapat dilihat pada Gambar 6.

Gambar 6 Kromatogram 9 fraksi hasil kolom dimulai dari fraksi etil asetat, fraksi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan 9 (kirike kanan).

Jumlah noda dan nilai Rf dari masing-masing fraksi dapat dilihat pada Lampiran 7. Hasil rendemen dapat dilihat pada Tabel 6 dengan rendemen tertinggi terdapat pada fraksi 2 sebesar 19.40%. Fraksi–fraksi ini kemudian diuji aktivitas inhibitor tirosinasenya.

Tabel 6 Rendemen fraksi hasil pemisahan fraksi etil asetat ekstrak air daun A. schottii Cipanas dengan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel

Fraksi Hasil Kolom Bobot (g) Rendemen (%) Fraksi 1 0.0209 1.60 Fraksi 2 0.2531 19.40 Fraksi 3 0.1641 1.58 Fraksi 4 0.1560 1.96 Fraksi 5 0.0608 4.66 Fraksi 6 0.1471 1.,28 Fraksi 7 0.1102 8.45 Fraksi 8 0.0838 6.42 Fraksi 9 0.0328 2.51

Fraksi 4 memiliki daya inhibisi tertinggi dengan nilai IC50 untuk aktivitas monofenolase sebesar 288.03 μg/mL dan nilai IC50 untuk aktivitas difenolasenya sebesar 486.5 μg/mL. Data nilai IC50 fraksi-fraksi hasil kolom fraksi etil asetat ektrak air daun daun A. schottii Cipanas dapat dilihat pada Tabel 7.

Tabel 7 IC50 fraksi-fraksi hasil kolom fraksi etil asetat ekstrak air daun A. schottii P. Cipanas Fraksi Hasil Kolom IC50(μg/mL) Monofenolase Difenolase Fraksi 1 - - Fraksi 2 1426.58 - Fraksi 3 575.01 595.39 Fraksi 4 288.03 486.53 Fraksi 5 611.13 959.19 Fraksi 6 487.83 1409.39 Fraksi 7 - - Fraksi 8 - - Fraksi 9 - - Asam kojat 0.012 128.74 Keterangan : (-) tidak mencapai IC50 hingga konsentrasi

2000 μg/mL.

Daya inhibisi ekstrak kasar dibandingkan dengan fraksi hasil pemisahan dengan kolom mengalami penurunan aktivitas. Hal ini dapat disebabkan adanya sifat saling meniadakan antara senyawa-senyawa yang dipisahkan sehingga aktivitasnya pun menurun. Kemungkinan ketika senyawa-senyawa tersebut bersatu dalam satu kesatuan dapat menginhibisi aktivitas enzim tirosinase dengan baik, namun ketika dipisahkan, daya penginhibisiannya akan berkurang.

Fraksionasi dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)

Fraksi 4 yang merupakan fraksi teraktif hasil fraksionasi dengan kromatografi kolom, namun fraksi ini masih belum murni karena dapat dilihat dari kromatogramnya, fraksi 4 memiliki 8 noda yang menumpuk sehingga harus dipisahkan atau dimurnikan lagi. Pemisahan dilakukan dengan menggunakan KLTP (Kromatografi Lapis Tipis Preparatif). Fraksionasi ini dilakukan dengan menggunakan eluen terbaik yaitu metanol : klorofom : n-heksana (1/6 : 2/3 : 1/6). Hasil fraksinasi dengan KLTP menghasilkan 8 fraksi dan kromatogramnya dapat dilihat pada Gambar 7.

Gambar 7 Kromatogram 8 fraksi hasil KLTP dimulai dari kiri ke kanan. Jumlah noda dan nilai Rf masing-masing fraksi hasil KLTP dapat dilihat pada Lampiran 7. Fraksi-fraksi hasil KLTP ini kemudian diuji aktivitas inhibitor tirosinasenya. Hasil pengujian diperoleh bahwa fraksi 4D memiliki daya penginhibisian tertinggi dibandingkan fraksi-fraksi lainnya dengan nilai IC50 sebesar 561.39 μg/mL untuk aktivitas monofenolase, sedangkan fraksi 4A, 4C, 4F, dan 4G memiliki daya penginhibisi dengan nilai IC50

lebih dari 1000 μg/mL yaitu secara berurut 1817.70 μg/mL (difenolase), 1881.36 μg/mL

(monofenolase), 1523.89 μg/mL (difenolase), dan 1260.61 μg/mL (difenolase). Fraksi 4D

belum dapat dikatakan murni karena pada kromatogramnya masih terdapat 4 noda dengan nilai Rf masing-masing noda dapat dilihat pada Lampiran 7. Hasil uji aktivitas enzim tirosinasenya dapat dilihat pada Tabel 8.

Tabel 8IC50 fraksi-fraksi hasil KLTP Fraksi KLTP IC50 (μg/mL) Monofenolase Difenolase 4A - 1817.70 4B - - 4C 1881.36 - 4D 561.39 - 4E - - 4F - 1523.89 4G - 1260.61 4H - - Asam kojat 0.012 128.74 Keterangan : (-) tidak mencapai IC50 hingga konsentrasi

2000 μg/mL.

Uji Fitokimia Lanjutan

Uji fitokimia lanjutan dilakukan untuk mengetahui golongan senyawa fraksi 4D sebagai senyawa yang aktif sebagai inhibitor enzim tirosinase. Fraksi 4D merupakan fraksi hasil pemisahan yang memiliki aktivitas terbaik. Hasil uji fitokimia lanjutan dapat dilihat pada Gambar 8.

Gambar 8 Warna uji kualitatif flavonoid pada KLT, yaitu (a) warna bercak, (b) sinar UV 254 nm, dan (c) dengan uap NH3.

Hasil KLT fraksi 4D dengan eluen terbaik diperoleh warna bercak coklat pekat saat disinari UV 254 nm dan timbul bercak hijau gelap kekuningan saat diuapi dengan uap NH3

(Gambar 8). Hal tersebut mengindikasikan bahwa senyawa tersebut positif termasuk senyawa flavonoid. Senyawa flavonoid yang terdapat di dalam tanaman alamanda diantaranya adalah isoflavon, flavonol (kaempferol dan kuersetin), dan juga flavanon (naringenin) (Schmidt et al. 2006). Hasil uji fitokimia lanjutan menunjukkan bahwa

pendugaan golongan senyawa flavonoid pada fraksi 4D adalah senyawa flavonol (Markham 1988).

Analisis Spektrofotometer UV-Vis dan FTIR Fraksi 4D

Fraksi 4D hasil fraksionasi menggunakan KLTP kemudian dianalisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Analisis ini dilakukan untuk mengetahui panjang gelombang maksimum dari fraksi 4D. Penapisan dilakukan dari panjang gelombang 200 nm hingga 800 nm. Hasil pengamatan diperoleh panjang gelombang maksimum dari fraksi 4D adalah 256 nm. Senyawa golongan flavonoid yang memiliki panjang gelombang maksimum 256 nm adalah senyawa flavonol Kisaran panjang gelombang maksimum untuk flavonol adalah 250-290 nm pada pita 2, dan 330-360 nm pada pita 1 (Markham 1988). Spektrum UV-Vis hasil penapisan panjang gelombang maksimum fraksi 4D dapat dilihat pada Lampiran 9.

Identifikasi senyawa aktif pada fraksi 4D juga dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer infra merah. Spektrum IR fraksi 4D dapat dilihat pada Lampiran 10 dan pendugaan gugus fungsi fraksi 4D dapat dilihat pada Tabel 9.

Tabel 9 Absorpsi inframerah gugus-gugus fungsi fraksi D

Bilangan Gelombang

(cm^-1) Literatur * Gugus Dugaan 3389.41 3100-3700 uluran OH 2852.39 2700-3000 Renggang C-H 1740.27 1650-1900 C=O (keton) 1083.03 650-1000 Renggang C=C aromatik Keterangan: *) Creswell et al.(2005).

Hasil analisis IR pada Tabel 9 menunjukkan adanya absorpsi IR gugus-gusus fungsi pada bilangan gelombang tertentu dengan pendugaan bahwa senyawa aktif tersebut merupakan golongan senyawa flavonoid. Beberapa senyawa flavonoid yang diketahui memiliki aktivitas sebagai inhibitor enzim tirosinase diantaranya golongan senyawa flavonol (kuersetin), flavon (noratokarpetin), flavanon (stepogenin), flavanol (dihidromorin dan taksifolin), isoflavan (gliasperin C, glabridin), kalkon, dan isoflavon (Kalikosin) (Chang 2009). Hasil yang diperoleh mendukung pendugaan (a) (b) (c)

senyawa aktif dengan uji fitokimia lanjutan dan juga spektrofotometer UV-Vis bahwa senyawa aktif yang berperan sebagai inhibitor

Dalam dokumen Potency of Alamanda in Bogor Area as Tyrosinase Inhibitor (Halaman 46-56)