METODOLOGI PENELITIAN
HASIL DAN PEMBAHASAN
Perlakuan awal (pre-treatment) terhadap serum Macaca fascicularis
Dalam serum mammalia, terdapat suatu penghambat nonspesifik yang akan mengganggu hasil yang diperoleh (Kathleen et al. 1990; Subbarao et al. 1992; Höfling et al. 1997; Rowe et al. 1999; Boliar et al. 2006). Penghambat nonspesifik ini akan bertindak seperti layaknya reseptor yang akan berinteraksi dengan HA dari virus influenza sehingga akan mencegah terjadinya aglutinasi dari sel darah merah (Subbarao et al. 1992 ; Rowe et al. 1999). Salah satu cara untuk menyingkirkan penghambat tersebut adalah dengan menggunakan Receptor Destroying Enzyme (RDE). RDE merupakan enzim neuraminidase yang akan merusak penghambat nonspesifik tersebut (Tizard 1982). Serum yang tidak diberikan RDE akan memperlihatkan hasil seperti terjadi hemaglutinasi (Gambar 9 & 10 (non-RDE)). Hal ini disebabkan apabila tidak terdapat virus dalam sumuran reaksi maka penghambat nonspesifik tersebut akan berikatan dengan sel darah merah sehingga terjadi hemaglutinasi (Boliar et al. 2006). Sementara serum yang diberikan RDE akan terlihat seperti kontrol RBC (mengendap). Hal ini membuktikan bahwa RDE bekerja dengan baik sehingga hasil yang diperoleh dapat dibaca dengan benar.
Gambar 9. Hasil positif antibodi terhadap antigen H5 pada uji hambat hemaglutinasi. Diperoleh nilai end point sebesar 32 (25) dengan virus standard 4
HAU.
Gambar 10. Hasil negatif antibodi terhadap antigen H5 pada uji hambat hemaglutinasi. Tidak terjadi penghambatan hemaglutinasi oleh virus standar 4
HAU. RDE nonRDE 1:8 1 6:1 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 kontrol RBC kontrol virus RDE nonRDE 1:8 1:16 1 2:3 1 4:6 1:128 1:256 1:512 kontrol RBC kontrol virus 1:1024
Sebaran sampel serum positif HI dan negatif HI
Dari uji hambat hemaglutinasi yang dilakukan, diperoleh data bahwa 124 sampel serum (94%) dari 132 sampel serum yang diuji, positif memiliki antibodi terhadap virus avian influenza (AI) subtipe H5, sementara delapan sampel serum sisanya (6%) tidak memiliki antibodi terhadap virus AI subtipe H5 (Tabel 1 dan Gambar 11).
Tabel 1. Jumlah sampel serum positif dan negatif
No Hasil Jumlah Serum
1. Positif 124 2. Negatif 8 Positif 94% Negatif 6%
Gambar 11. Persentase sampel serum positif HI dan negatif HI
Tingginya persentase hasil positif dari sampel serum M. fascicularis yang diuji mengindikasikan bahwa satwa tersebut pernah terpapar secara alami oleh virus avian influenza subtipe H5. Sebagian besar M. fascicularis yang diperiksa serumnya, awal mulanya berasal dari hutan untuk kemudian ditangkarkan di penangkaran sistem terbuka (out door). Keadaan ini menumbuhkan asumsi bahwa terdapat kemungkinan M. fascicularis tersebut terpapar oleh virus avian influenza pada saat di hutan (sebelum ditangkarkan), meskipun asumsi lain tentang kejadian infeksi terjadi pada saat ditangkarkan juga dimungkinkan.
Sementara itu di penangkaran, M. fascicularis dapat terpapar oleh virus avian influenza melalui udara dan sanitasi dari lingkungan sekitar penangkaran, khususnya pada penangkaran yang berada di dekat lokasi yang diketahui pernah terjadi kasus AI pada ayam. Hal ini masih membutuhkan penelusuran lebih lanjut,
sehingga dapat dipastikan apakah M. fascicularis tersebut terpapar virus AI di hutan atau di penangkaran.
Avian influenza memiliki dua antigen utama yaitu Hemagglutinin (HA) dan Neuraminidase (NA). Antigen HA berperan pada proses attachment dari virion ke reseptor permukaan sel, selain itu HA juga berperan pada aktivitas hemagglutinasi dari virus. Sementara NA berperan pada proses keluarnya virus dari sel inang (Easterday dan Hinshaw 1991). Antibodi yang terbentuk dalam tubuh hewan bereaksi terhadap antigen HA yang terdapat pada permukaan luar virus. Terdapat 16 varian antigen Hemaglutinin (H1 sampai dengan H16) dan 9 jenis antigen Neuraminidase (N1 sampai dengan N9) pada kelompok virus ini (Carter et al. 2006), sehingga dengan demikian virus ini mempunyai 144 kemungkinan variasi subtipe. Dengan tingginya variasi subtipe dari virus ini maka tidak tertutup kemungkinan terjadinya reaksi silang antar subtipe sangat besar. Namun berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Lee et al. (2006) yang melakukan penelitian untuk melihat kemungkinan reaksi silang antara 15 antigen hemaglutinin dengan menggunakan uji hambat hemaglutinasi, ditunjukan bahwa tidak terdapat reaksi silang dari masing-masing subtipe, walaupun antara antigen H15 dengan antisera H7 terjadi penghambatan hemaglutinasi namun dengan end
point yang rendah yaitu 23-24. Dari penelitian tersebut dapat terlihat bahwa uji
hambat hemagglutinasi merupakan uji yang spesifik untuk mengetahui keberadaan antibodi spesifik terhadap antigen HA pada virus avian influenza. Sehingga apabila terdapat antibodi spesifik yang mampu berikatan dengan antigen HA, maka hemaglutinasi tidak akan terjadi (dihambat), atau dengan kata lain kemungkinan terjadinya reaksi silang hanya terbatas pada subtipe dengan antigen HA yang sama. Adanya antibodi yang mampu menghambat hemagglutinasi mengindikasikan bahwa terdapat ikatan spesifik antibodi dengan subtipe antigen yang digunakan dan titer antibodi yang diperoleh memiliki korelasi positif dengan tingkat pertahanan tubuh hewan tersebut (Yoon et al. 2004).
Sebaran sampel serum positif HI berdasarkan jenis asal penangkaran
Berdasarkan jenis asal penangkarannya diperoleh sebaran sampel serum yang positif dengan uji hambat hemaglutinasi tertinggi pada penangkaran M. fascicularis yang terdapat peternakan ayam dalam radius kurang dari dua kilometer dari penangkaran tersebut (jenis penangkaran B), yaitu sebesar 100%. Sementara itu penangkaran yang terletak pada suatu pulau (jenis penangkaran A) memiliki sebaran sampel yang positif dengan uji hambat hemaglutinasi sebesar 97,7% dan penangkaran yang terletak pada suatu daerah yang jauh dari peternakan ayam (jenis penangkaran C) menunjukan sebaran sampel yang positif dengan uji hambat hemaglutinasi sebesar 89,4% (Tabel 2). Pada penangkaran B terdapat asumsi bahwa selain M. fascicularis kemungkinan pernah terpapar oleh virus avian influenza subtipe H5 pada saat di hutan dimungkinkan juga asumsi kejadian paparan oleh virus avian influenza subtipe H5 yang berasal dari daerah sekitar penangkaran yang banyak terdapat peternakan ayam. Pada penangkaran A M. fascicularis kemungkinan pernah terpapar oleh virus avian influenza yang berasal dari unggas liar yang banyak ditemukan pada daerah tersebut, namun hal tersebut masih perlu penelitian lebih lanjut terhadap keberadaan kasus avian influenza pada unggas liar mengingat hingga saat ini belum terdapat data mengenai keberadaan kasus AI pada daerah tersebut, padahal hingga saat ini terdapat 90 spesies unggas dari 13 ordo unggas yang hidup di alam bebas dilaporkan pernah terinfeksi virus avian influenza (Stallknecht and Brown 2007). Sementara itu pada jenis penangkaran C meskipun memiliki sebaran sampel yang positif uji hambat hemaglutinasi terendah dibandingkan kedua jenis penangkaran lainnya namun prevalensi yang terjadi masih cukup tinggi. Terdapat asumsi bahwa kemungkinan pada penangkaran C M. fascicularis pernah terpapar oleh virus AI sebelum ditangkarkan atau selama masih di hutan yang berasal dari unggas liar, walaupun kemungkinan terpapar dari unggas liar sekitar penangkaran masih memungkinkan terjadi. Sebagai perbandingan, sebelumnya telah dilakukan uji terhadap 13 serum anakan beruk (Macaca nemestrina) yang lahir dan dibesarkan pada jenis penangkaran indoor yang berusia sekitar satu hingga satu setengah tahun. Dari uji tersebut diperoleh hasil sebanyak 9 dari 13 serum yang diuji (69,23%) negatif dalam uji HI. Hasil tersebut masih perlu ditindaklanjuti
mengingat jumlah sampel yang terlalu sedikit, sehingga diperlukan penyertaan jumlah sampel lebih banyak untuk jenis satwa primate beruk, serta diperlukan pula penyertaan serum dari monyet ekor panjang (M. fascicularis) dari jenis penangkaran indoor.
Tabel 2. Sebaran sampel serum positif uji hambat hemaglutinasi (uji HI)
menggunakan virus AI subtipe H5 yang dikelompokkan berdasarkan jenis asal penangkaran.
Jenis Penangkaran Positif uji HI
Negatif uji HI
Sebaran sampel positif
A 44 1 97,7%
B 21 0 100%
C 59 7 89,4%
Total 124 8 94%
Sebaran sampel serum berdasarkan tingkatan end point
Ketika terpapar oleh antigen maka tubuh hewan akan melakukan respon kebal. Keberadaan virus sebagai antigen dalam tubuh akan mendatangkan makrofag yang akan memfragmentasikan virus tersebut dan selanjutnya akan dipresentasikan kepada sel limfosit T melalui molekul Major Histocompatibility Complex (MHC) yang terletak dipermukaan makrofag. Sel T helper (Th) mengenali antigen yang berikatan dengan molekul MHC II. Interaksi antara sel Th dan APC akan menginduksi pengeluaran sitokin atau interleukin yang merupakan alat komunikasi antar sel sehingga akan menginduksi pematangan sel limfosit B menjadi sel plasma yang akan menghasilkan antibodi. Antibodi yang dihasilkan dari proses ini hanya bereaksi dengan antigen yang bersirkulasi dalam darah maupun yang berada di permukaan sel, sehingga disebut sebagai kekebalan humoral atau kekebalan permukaan (Wibawan et al. 2003). Pada uji hambat hemagglutinasi yang dilakukan dalam penelitian ini diperoleh nilai yang menggambarkan titer antibodi yang terbentuk akibat keberadaan (keterpaparan) antigen.
Dari 124 sampel serum yang bereaksi positif diperoleh nilai end point berkisar dari 16 (24) sampai 256 (28) dengan menggunakan virus standar 4 HAU. Jumlah sampel serum terbanyak yaitu pada end point 128 (27) sebanyak 59 sampel serum (47%), sementara jumlah sampel serum terendah adalah pada end point 16 (24) sebanyak 4 sampel (3%). (Tabel 3 dan Diagram 2).
Tabel 3. Jumlah sampel serum dari masing-masing tingkatan end point dengan
virus standar 4 HAU
End point Jumlah Sampel Serum
16 (24) 4 32 (25) 11 64 (26) 33 128 (27) 59 256 (28) 17 3% 9% 27% 47% 14% 16 32 64 128 256
Gambar 12. Persentase jumlah serum dari masing-masing tingkatan end point
dengan virus standar 4 HAU
Bervariasinya nilai titer antibodi berhubungan dengan tingkat pertahanan tubuh terhadap antigen (Yoon et al. 2004). Semakin tinggi titer antibodi menunjukan bahwa semakin banyak antibodi yang mampu berikatan dengan virus sehingga hemagglutinasi tidak terjadi.