Penelitian mengenai analisis profil genetik dan kemotaksonmi aktinomisetes yang dilakukan di LIPI Cibinong dari bulan Maret hingga Agustus 2015 ini menggunakan 10 isolat yang sebelumnya telah diisolasi dan diperservasi menggunakan metode Freeze Drying. Isolat yang digunakan disajikan pada Tabel 14.
Tabel 14. Isolat yang digunakan di dalam penelitian
No
. Kode Isolat Suumber Isolat
Tanggal Isolasi Tempat pengambilan sampel Metode Isolasi 1 ID04-1019 Daun-daun 23/08/200 4 Jambi RC 2 ID04-1052 Daun-daun 09/08/200 4 Jambi RC 3 ID04-1066 Daun-daun 09/08/200 4 Jambi RC 4 ID04-1067 Daun-daun 09/08/200 4 Jambi RC 5 ID04-1071 Daun-daun 09/08/200 4 Jambi RC 6 ID04-1088 Daun-daun 09/08/200 4 Jambi RC 7 ID04-1093 Daun-daun 09/08/200 4 Jambi RC 8 ID04-1103 Daun-daun 09/08/200 4 Jambi RC 9 ID05-0653 Tanah 21/09/200 5 Timor RC 10 ID06-0464 Tanah 14/08/200 6 Lombok SDS-YE
Isolat yang digunakan, sebelumnya didapatkan dengan mengisolasi aktinomisetes dari daun-daun yang berada di Jambi serta tanah yang berada di
Timor dan Lombok. 10 ampul berisi isolat yang telah diperservasi kemudian dibuka dan ditumbuhkanpadai medium ISP 2 cair kemudian ke padat pada cawan petri menggunakan metode pour plate. Isolat di inkubasi di dalam inkubator selama 1 minggu dengan suhu 37 oC. Setelah isolat di dalam petri tumbuh,
dilakukan purifikasi sebanayak 2 kali agar didapatkan isolat yang murni. Hasil isolat yang telah dipurifikasi disajikan pada Gambar 6.
1. 2. 3.
4. .
Gambar 6. Isolat pada Medium ISP2 Padat. 1. Isolat ID04-1019, 2. Isolat ID04-1052, 3. Isolat ID04-1066, 4. Isolat ID04-1067, 5. Isolat ID04-1071, 6. Isolat ID04- 1088, 7. Isolat ID04-1093, 8. ID04-1103, 9. ID05-0653, 10. ID-06-0464.
Pada analisis DAP, digunakan metode Thin-Layer Chromatoghraphy atau TLC bahwa secara plastic sheet sebagai fase stationer nya dan solvent sebagai fase gerak nya. Hasil DAP yang terlihat akan berwarna ungu ataupun coklat gelap dan jika dibandingkan dengan standar akan terlihat isomer apakah dari DAP yang dianalisis. Hasil dari analisis DAP disajikan pada Gambar 7.
7. 8. 9.
Gambar 7. Hasil TLC untuk analisis DAP isolat pada TLC plastic sheet
Melalui hasil percobaan ini, dapat terlihat pada Gambar 7. bahwa DAP yang dijalankan pada TLC plastic sheet melewati DAP standar tetapi terlihat juga bagian yang berwarna coklat gelap sejajar dengan DAP standar. Hal ini dapat terjadi dikarenakan terlalu lamanya TLC plastic sheet di dalam solvent dan terlalu banyaknya spotting yang dilakukan sehingga melewati standar. Akan tetapi hasil ini masih bisa dibaca, dengan membandingkan melalui DAP standar bahwa di dalam TLC plastic sheets yang terlihat didalam Gambar 7. terdapat spot berwarna ungu di bagian atas maupun bawah dan juga tedapat bagian coklat yang sejajar dengan DAP standar. Hal ini menunjukkan bahwa DAP yang dimiliki isolat merupakan meso-DAP dan jika LL-DAP yang ada maka hanya ada satu bagian saja yang berwarna ungu serta bagian yang coklat gelap pada isolat sejajar dengan meso-DAP. Meso-DAP memiliki nilai Rf lebih rendah dibandingkan dengan LL- DAP sehingga sewaktu dijalankan di dalam solvent akan terlihat bahwa LL-DAP lebih diatas dibandingkan meso-DAP. Metode analisis DAP didasari melalui prinsip pengunaan thin-layer chromatography (TLC) bahwa asam amino akan
bergerak ke atas pada TLC plastic sheet. Hasil analsis DAP pada isolat disajikan pada Tabel 15.
Tabel 15. Analsis DAP menggunakan TLC.
No. Kode Isolat Hasil analisis DAP
1 ID04-1019 meso-DAP
2 ID04-1052 meso-DAP
3 ID04-1066 meso-DAP
4 ID04-1067 meso-DAP
5 ID04-1071 meso-DAP
6 ID04-1088 meso-DAP
7 ID04-1093 meso-DAP
8 ID04-1103 meso-DAP
9 ID05-0653 meso-DAP
10 ID06-0464 meso-DAP
DAP merupakan asam amino intermediate yang selanjutnya akan membentuk asam amino lysine. Asam amino ini ditemukan di semua bakteri gram-negatif bahwa biasanya asam amino ini melalui ikatan peptida terikat pada ikatan NAM-NAG dinding sel serta di beberapa bakteri gram-positif bahwa DAP ditemukan pada mucopeptida atau peptidoglikan bakteri tersebut. Terdapat 3 macam isomer dari DAP yaitu meso-DAP, LL-DAP dan DD-DAP. Pada bakteri gram-positif seperti aktinomisestes ataupun gram-negatif umum dijumpai DAP dalam bentuk meso-DAP tetapi LL-DAP dan DD-DAP jarang dijumpai pada bakteri gram-negatif. Pada aktinomisetes memang umum dijumpai meso-DAP pada dinding sel bakteri aktinomisetes tersebut sehingga analisis DAP ini bisa menjadi salah satu penunjuk untuk identifikasi akan tetapi masih perlu didukung data-data lainnya seperti data kemotaksonomi lainnya ataupun data pendukung seperti profil genetik yang mampu memberikan hasil identifikasi juga sehingga hasil identifikasi akan lebih akurat walaupun data yang ada masih memiliki kekurangan seperti belum seluruh data mengenai kemotaksonomi isolat yang dilakukan.
Untuk selanjutnya, isolat yang dianalisis menggunakan metode kemotaksonomis yaitu gula dari sel, asam lemak, menaquinon dan asam lemak hanya dilakukan pada isolat ID05-0653 dan isolat ID06-0464 dikarenakan adanya keterbatasan di laboratorium yaitu permasalahan teknis dimana kurangnya bahan
untuk melakukan penelitian, keterbatasan waktu dan diharuskannya berpindah antara laboratorium. Analisis selanjutnya yang dilakukan yaitu gula dari sel. Prinsip dasar yang digunakan masih sama yaitu menggunakan Thin-Layer Chromatoghraphy bahwa TLC plastic sheet merupakan fase stationer dan solvent merupakan fase geraknya. Pada analisis gula sel hasil disajikan pada Tabel 16.
Tabel 16. Hasil analisis gula sel menggunakkan TLC
No Isolat Gula Sel
1 ID05-0653 Galactose, Ribose, Mannose, Arabinose, Rhamnose 2 ID06-0464 Galactose, Ribose, Mannose, Arabinose, Rhamnose
Analisis gula dari sel memerlukan biomassa kering dari sel yang telah disiapkan sebelumnya. Prinsip pada analisis gula sel memiliki persamaan dengan analisis DAP dengan perbedaan pada analisis gula sel hanya melihat gula dari sel saja dengan menggunakan standar TLC gula yang memberikan ciri khas tersendiri bagi suatu spesies dan dari sini dapat terlihat juga tipe dinding sel yang dimiliki oleh suatu spesies. Berdasarkan Tabel 16. dapat terlihat bahwa isolat memilki gula pada selnya berupa Galactose, Ribose, Mannose, Arabinos dan Rhamnose. Deteksi gula sel ini terutama gula yang terdapat pada dinding sel setelah dilakukan hidrolisis sel sehingga dapat terlihat gula yang ada.
Analisis gula sel sering digunakan untuk mengindentifikasi bakteri, terutama aktinomisetes. Secara umum hasil analisis gula sel pada aktinomisetes dapat dihasilkan gula sel berupa Galactose, Arabinose, Xylose, Rhamnose, Mannose, Glucose dan Madurose. Gula sel ini merupakan penyusun dinding sel pada aktinomisetes. Meskipun hasil analisis gula sel menjadi penanda kemotaksonomi yang penting di dalam proses identifikasi aktinomisetes, gula sel pada aktinomisetes dapat bervariasi tergantung dari kondisi pengkulturan sehingga menjadi karakter yang kurang stabil dibandingkan karakter lain yang bisa diperhatikan
Xylose, Arabinose, Galctose dan Madurose merupakan gula penanda dari class Actinobacteria sehingga dengan adanya salah satu atau lebih dari gula ini
dapat mengindikasikan kemungkinan isolat yang diteliti merupakan anggota dari class Actinobacteria (Rainey & Oren, 2011).
Selanjutnya dilakukan analisis Menaquinon. Analisis Menaquinone dilakukan dengan Liquid Chromatoghraphy – Mass Spectrometry. LC-MS menggunakan kombinasi pemisahan yang digunakan pada HPLC dan analisis yang dilakukan oleh MS. Aplikasi dari LC-MS lebih berorientasi pada pemisahan substansi dan deteksi berdasarkan substansi kimia lainnya. HPLC adalah pemisahan dengan menggunakan kolom khusus sebagai fase stasioner bahwa cairan dipaksa melewati kolom tersebut sehingga terjadilah pemisahan. Untuk MS, prinsip teknik ini adalah untuk mengukur massa partikel. Dari hasil analisis yang dilakukan disajikan pada Tabel 17.
Tabel 17. Analisis menaquinon menggunakan LC-MS
No Isolat Menaquinon
1 ID05-0653 MK-9(H4) (100%)
2 ID06-0464 MK-9(H4) (100%)
Menaquinon merupakan vitamin K2 yang dapat disintesis oleh bakteri. Menaquinon dapat menjadi suatu penanda kemotaksonomi yang bernilai tinggi karena hasil sintesis menaquinon untuk setiap bakteri memberikan hasil sintesis yang unik sehingga mampu menjadi penanda kemotaksonomi. Berdasarkan hasil analisis yang dilakukan, dapat diketahui bahwa kedua isolat memiliki menaquinon MK-9(H4). MK-9 adalah senyawa kimia Vitamin K2 yang memilki rantai samping
isoprene sejumlah 9 buah dan H4 berarti 4 diantaranya mengalami hidrogenasi.
Menurut Meurant (1987) hanya bakteri gram-positif memiliki menaquinon. Aktinomisetes memiliki menaquinone dengan panjang rantai isoprene, junlah hidrigenasi dan komposisi molar yang berbeda-beda. Aktinomisetes pembentuk spora memiliki panjang rantai isoprene yang terhidrogenasi tinggi serta komposisi molar yang kompleks sebaliknya aktinomisetes dengan struktur primitif memiliki komposisi yang sederhana. Berdasarkan Tabel 17. hasil analisis menaquinon menunjukkan bahwa menaquinon yang didapatkan hanyalah satu jenis saja dengan rantai panjang dan mengalami hidrogenasi berkali-kali sehingga bisa diperkirakan isolat merupakan aktinomisetes yang mampu menghasilkan spora dan memiliki komposisi molar yang kompleks.
Analisis selanjutnya yang dilakukan adalah analisis asam lemak. Analisis asam lemak dilakukan dengan menggunakan Gas Chromatoghrapy – Mass Spectrometry. GC-MS menggunakan prinsip bahwa pemisahan dilakukan menggunakan alat Gas Chromatograph yang fase geraknya merupakan gas dan fase diamnya merupakan kolom. Hasil analisis asam lemak disajikan pada Tabel 18.
Tabel 18. Analisis asam lemak menggunakan GC-MS
No Isolat Asam Lemak
1 ID05-0653 14:0 ISO 11.67% 15:0 ISO 7.21% 15:0 5.96% 16:1 ISO H 13.4% 16:0 ISO 55.5% 16:0 ISO 2H 6.25% 2 ID06-0464 16:1 ISO H 21.74% 16:0 ISO 59.98% 16:0 ISO 2H 6.25%
Sesuai dengan penamaan pada asam lemak angka didepan menunjukkan banyaknya rantai karbon pada asam lemak, angka kedua menunjukkan seberapa banyak rantai yang memiliki ikatan ganda, ISO menunjukkan adanya gugus methyl pada rantai terakhir dan H menunjukkan posisi bahwa terdapat gugus H pada rantai karbon tersebut. Dapat terlihat pada Tabel 18. terdapat perbedaan antara asam lemak yang dimiliki oleh isolat ID05-0653 dan ID06-0464. Hal ini dapat menjadi indikator pembeda dan karakteristik unik setiap spesies.
Menurut Whitman (1987) analisis asam lemak dapat dipengaruhi oleh lingkungan sekitar sehingga dapat memberikan hasil yang berbeda tergantung dari medium yang digunakan. Selain itu waktu pertumbuhan juga berpengaruh terhadap hasil asam lemak yang didapatkan tetapi tidak terlalu signifikan sehingga siklus pertumbuhan dari bakteri tidak perlu terlalu diamati di dalam analisis asam lemak. Hal yang perlu diperhatikan hanya medium yang digunakan untuk pertumbuhan. Analisis asam lemak juga lebih baik dilakukan jika isolat yang dianalisis berasal dari kultur yang ditumbuhkan pada medium cair dikarenakan hasil analisis asam lemak dapat berubah melalui spora yang dihasilkan terutama pada medium padat. Pada penelitian kali ini, medium yang digunakan untuk
pertumbuhan adalah medium cair ISP2 sehingga hasil yang didapatkan lebih valid.
Selanjutnya analisis yang dilakukan adalah analisis fosfolipid. Analisis fosfolipid dilakukan dengan menggunakan Thin-Layer Chromatoghraphy. Hasil analisis fosfolipid disajikan pada Tabel 19.
Tabel 19. Analisis fosfolipid menggunakan TLC
No Isolat Tipe Fosfolipid Fosfolipid
1 ID05-0653 PII PE,PME, lyso-PE,
DPG, PIM, NPG
2 ID06-0464 PII PE,PME, lyso-PE,
DPG, PIM, NPG Keterangan :
PE = Phosphatidylethanolamin
PME = Phosphatidylmethylethanolamine lyso-PE = lyso- Phosphatidylethanolamin DPG = Diphosphatidylglycerol
PIM = Phosphatidylinositol mannoside NPG = Ninhydrin-positive glycophospholipid
Fosfolipid merupakan lipid yang merupakan bagian penting dari membran sel. Mereka dapat membentuk lipid bilayer karena karakterisitiknya yang merupakan amphiphilic. Struktur dari fosfolipid secara umum terdapat 1 bagian kepala gugus fosfat yang hidrofilik dan 2 bagian ekor yang hidrofobik. Fosfolipid terikat oleh ikatan gliserol. Pada fosfolipid terdapat Tipe fosfolipid P yang merupakan fosfolipid tanpa gugus nittrogenous dan tipe fosfolipid PII bahwa phosphatidylethanolamine sebagai fosfolipid yang terdeteksi. Pada kedua isolat terdapat fosfolipid yang terdeteksi seperti yang terlihat pada tabel 19 yaitu PE ( Phosphatidylethanolamin), PME (Phosphatidylmethylethanolamine), lyso-PE, DPG (Diphosphatidylglycetol), PIM (phosphatidylinositol mannoside) dan NPG (ninhydrin-positive glycophospholipid).
Aktinomisetes memiliki 5 macam pola yang berbeda pada membran sel dan karena itulah analisis fosfolipid mampu memberikan karakter khas yang mampu menjadi penciri khas. 5 pola tersebut adalah tipe I, II, III, IV, dan V. Tipe I adalah bakteri yang tidak memiliki nitrogenous fosfolipid. Tipe II adalah bakteri yang memiliki fosfolipid berupa phosphatidyl ethanolamine. Tipe III adalah
bakteri yang memiliki fosfolipid berupa phosphatidyl choline. Tipe IV adalah bakteri yang memiliki fosfolipid berupa glucosamine. Tipe V adalah bakteri yang memiliki fosfolipid berupa phosphatidyl glycerol. Selain itu terdapat juga fosfolipid yang bukan merupakan penanda pola fosfolipid akan tetapi mampu menjadi indikator untuk melakukan identifikasi dikarenakan secara umum spesies yang masuk di dalam suatu anggota genus tertentu akan memiliki kemiripan pada pola dan fosfolipid yang dimiliki (Bora et al., 2015).
Untuk mendukung identifikasi dari isolat, maka dilakukan profil genetik seperti pembuatan pohon filogenetik dan determinasi G+C content dari isolat. Untuk pembuatan pohon filogemetik, didasari berdasarkan kedekatan antar spesies melalui hasil sequencing gen 16S rRNA dari isolat yang sebelumnya menggunakan BLAST untuk mencari kedekatannya dan selanjutnya dibandingkan dengan spesies dalam genus yang ditemukan mendekati dari hasil BLAST menggunakan pohon filogenetik sehingga bisa terlihat jelas kedekatan antar isolat dengan spesies yang ada.
Sequencing 16S rRNA sebelumnya telah dilakukan oleh peneliti dari LIPI sehingga dalam penelitian kali ini hasil sequencing ini akan langsung digunakan untuk membantu mendukung identifikasi isolat. Hasil sequencing gen 16S rRNA dengan menggunakan bantuan BLAST yang dibandingkan dengan data daari GENE BANK dapat ditemukan genus yang paling mendekati isolat. Hasil yang didapatkan dari pencarian menggunakan BLAST disajikan pada Tabel 20.
Tabel 20. Hasil pencarian isolat menggunakan BLAST
No. Kode
Isolat Hasil BLAST
Kedekatan Accesion Number Base Pairs 1 ID04- 1052 Actinolpanes sp. 98% LC049065.1 1458 2 ID04- 1066 Actinolpanes sp. 99% LC049066.1 1462 3 ID04- 1067 Actinolpanes sp. 98% AB546286.1 1471
4 ID04- 1071 Actinolpanes sp. 99% NR_112103. 1 1419 5 ID04- 1088 Actinolpanes sp. 98% KC554663.1 1461 6 ID04- 1093 Actinolpanes sp. 99% KM396267.1 1423 7 ID04- 1103 Actinolpanes sp. 99% LC049066.1 1461 8 ID05- 0653 Actinophytocola timorensis 100% NR_112954. 1 1476 9 ID06- 0464 Actinophytocola corallina 100% NR_112955. 1 1484
Dikarenakan tidak adanya data hasil sequence gen 16S rRNA pada isolat ID04-1019 maka dalam penelitian kali ini tidak dimasukkan untuk diberlakukan pencarian menggunakan BLAST. Hasil BLAST yang tidak mencapai 100% selanjutnya dianalisis lebih lanjut menggunakan pohon filogenetik dan genus yang telah didapatkan mendekati sebelumnya dari hasil BLAST selanjutnya dicari seluruh spesies yang terdaftar di dalam Euzeby : List of Procaryotes Name with Standing in Nomenclature untuk menjadi pembanding dari isolat di dalam pohon filogenetik sehingga dapat terlihat dengan jelas sedekat apakah isolat yang dianalisis dengan suatu spesies. Tujuan pembuatan pohon filogenetik ini secara umum untuk memperkirakan hubungan antar sequemce dan untuk mengetahui asal usul ataupun spesies pendahulu yang sama dari sequence. Pembuatan pohon filogenetik sekarang sudah didasari dari sequence DNA. Menurut Hall (2013) secara dasar pembuatan pohon filogenetik dibagi menjadi 4 tahap yaitu 1. Identifikasi dan mendapatkan set DNA atau sequence protein homolog, 2. Meng- align sequence, 3. Memperkirakan pohon yang akan digunakan dan 4. Mempresentasikan pohon sebaik mungkin sehingga seluruh informasi dapat diketahui oleh pembaca.
Pembuatan filogenetik dilakukan dengan menggunakan program MEGA6 yang berungsi sebagai program untuk meng-align sequence maupun pembuat pohon filogenetik. Dalam penelitian kali ini, digunakan sequence gen 16S rRNA
sebagai data untuk diketahui kedekatan antar isolat dan membantu identifikasi. Dipergunakannya genn 16S rRNA ini dikarenakan gen tersebut adalah gen yang tidak terlalu berubah dari jaman dulu hingga sekarang sehingga lebih mudah untuk mengetahui kedekatan antar spesies menggunakan gen 16S rRNA Pembuatan pohon filogenetik diawali dengan memasukkan sequence gen kedalam notepad agar selanjutnya dibuat dalam file FASTA bahwa program MEGA6 hanya dapat membaca file untuk sequence dalam bentuk FASTA saja. Pembandingnya yaitu seluruh spesies yang terdaftar di dalam genus Actinoplanes juga dicari gen 16S rRNA melalui Euzeby dan dimasukkan kedalam satu file FASTA yang sama dengan isolat yang ingin dicari kedekatannya. Isolat yang masih belum diketahui secara pasti dikarenakan dari hasil BLAST belum mencapai kedekatan sebesar 100% maka perlu dipergunakan pohon filogenetik untuk melihat sedekat apa ketujuh isolat lainnya dengan spesies yang telah terdaftar pada Euzeby. Program MEGA6 digunakan untuk membantu pembuatan pohon filogenetik (Gambar 8.).
Gambar 8. Interface program MEGA6
Setelah memasukkan data sequence gen ke dalam FASTA selanjutnya dilakukan alignment menggunakan program ClustalW yang telah tersedia di dalam program MEGA6. Pengunaan program alignment ini bertujuan untuk menyusun kodon-kodon basa setiap sequence isolat agar sejajar dan menunjukkan kedekatan antar spesies. Proses alignment disajikan pada Gambar 9.
Gambar 9. Hasil alignment sequence gen 16S rRNA menggunakan ClustalW
Berdasarkan Gambar 9 dapat terlihat bahwa alignment dilakukan dengan mengurutkan basa-basa gen sehingga bisa terlihat jelas kedekatan antar isolat. Selanjutnya data ini dianalis dengan menggunakan program MEGA6 juga untuk diproses menjadi pohon filogenetik. Pembuatan pohon ini dilakukan dengan menggunakan metode neighbor-joining. Pemilihan metode ini dikarenakan metode ini memasangkan setiap sequence isolat yang kedekatannya paling dekat sehingga digabungkan menjadi satu cabang dan setelah itu dilakukan evaluasi kembali dengan pasangan lainnya kemudian kembali dikalkulasikan ulang hingga semua sequence sehingga bisa dihasilkan pohon filogenetik dengan hasil yang paling menunjukkan kedekatan antar spesies. Metode neighbor-joining hanya baik digunakan jika data yang digunakan adalah sequence gen sehingga dalam penelitian kali ini, salah satu alasan digunakannya metode ini adalah karena hal tersebut. Pembuatan pohon filogenetik selanjutnya menggunakan parameter seperti yang disajikan pada Gambar 10.
Gambar 10. Parameter analisis untuk pembuatan pohon filogenetik pada program MEGA6 Seperti terlihat pada Gambar 10 bahwa ada beberapa parameter spesifik yang digunakan dalam pembuatan pohon filogenetik kali ini. Pada penelitian kali ini digunakan metode bootstrap dengan pengulangan sebanyak 1000 kali untuk tes pohon filogenetik yang dilakukan. Metode bootstrap adalah teknik berbasis komputer untuk memperikirakan keakuratan suatu perkiraan statisitka (Efron et al., 1996). Bootstrap di dalam pembuatan pohon filogenetik ini digunakan untuk memperkirakan keakuratan kedekatan antar spesies yang telah dihasilkan oleh pohon filogenetik berdasarkan metode neighbor-joining. Bootstrap tidak menilai realibitas keseluruhan pohon filogenetik, akan tetapi yang diperkirakan keakuratanya merupakan setiap pasang atau cabang dari pohon filogenetik sehingga bisa diketahui bagian manakah dari pohon filogenetik yang dapat dipercaya atau tidak. Secara umum hanya bagian yang memilki nilai bootstrap lebih dari 70 persen yang dapat dipercaya (Hall, 2013). Parameter yang selanjutnya diperhatikan adalah model yang akan digunakan didalam pembuatan pohon filogenetik. Di dalam penelitian kali ini, dipilih parameter Kimura-2. Model yang dimaksud adalah model untuk menghitung jarak kedekatan antar
sequence dengan memformulasikanya dalam suatu matrix sehingga dapat dihasilkan suatu pohon filogenetik dengan tingkat kepercayaan tertentu. Berbeda model akan menghasilkan pohon filogenetik yang berbeda pula. Pemilihan Kimura-2 parameter di dalam penelitian kali ini didasari karena menurut Prasetya et al. (2011) bahwa pengunaan kimura-2 parameter di dalam metode pohon filogenetik neighbour-joining akan memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan model lain, terutama jika berhadapan dengan banyak data nukleotida.
Pembuatan pohon filogenetik pada penelitian ini menggunakan data sequence gen 16S rRNA dari ketujuh isolat, 40 spesies yang terdaftar dalam genus Actinoplanes sp. serta 1 outgroup yaitu Streptomyces albus. Outgroup merupakan pembanding di dalam pohon filogenetik yang telah diketahui sebelumnya kedekatannya dengan suatu spesies sehingga bisa memperlihatkan seberapa jauh jarak antar suatu sequence yang dibuat dalam pohon filogenetik dengan sequence diluar dari genus yang sedang diteliti. Hasil disajikan pada Gambar 11.
A.auranticolor(JCM 3038) A.lobatus(NBRC 12513) A.sichuanensis(03-723) A.xinjiangensis(03-8772) A.couchii(JCM 15999) A.italicus(JCM 3165) A.derwentensis(JCM 7556) A.philippinensis(JCM 3011) A.utahensis(JCM 3122) A.campanulatus(JCM 3059) A.capillaceus(JCM 10268) A.palleronii(JCM 7626) A.rectilineatus(JCM 3194) ID04A1071 050811 A.cyaneus(JCM 9082) A.liguriensis(JCM 3250) A.siamensis(A-T 6646) A.missouriensis(JCM 3121) A.lutulentus(NEAU-GRX6) A.ianthinogenes(JCM 3249) A.octamycinicus(JCM 9649) A.regularis(JCM 3062) A.teichomyceticus(JCM 3252) A.durhamensis(JCM 7625) A.consettensis(JCM 7624) A.humidus(JCM 7555) A.friuliensis(DSM 7358) A.nipponensis(DSM 43867) A.digitatis(JCM 3060) A.caeruleus(JCM 3195) A.abujensis(A4029) A.brasiliensis(JCM 3196) A.atraurantiacus(Y16) A.deccanensis(JCM 3247) ID04A1066 050811 ID04A1103 050811 A.ferrugineus(JCM 3277) A.tereljensis(NBRC 105297) A.toevensis(NBRC 105298) ID04A1052 050811 ID04A1067 050811 ID04A1093 050811 ID04A1088 050811 A.globisporus(JCM 3186) A.rishiriensis(NBRC 108556) A.minutisporangius(JCM 9458) A.armeniacus(JCM 3070) S.albus (DSM 40313T) 99 99 62 86 79 91 99 95 76 98 78 95 97 30 70 79 65 43 36 50 55 23 98 54 48 23 95 97 99 52 70 59 29 43 60 31 57 19 9 36 38 29 15 52 9 0.01
Gambar 11. Pohon filogenetik 7 isolat dengan mennggunakan metode neighbour-joining dan model kimura-2 parameter
Berdasarkan Gambar 11 dapat terlihat hasil pohon filogenetik yang telah dibuat menggunakan porgram MEGA6. Dari pohon ini, dapat diketahui bahwa setiap isolat memiliki kedekatan masing-masing dengan spesies yanng berbeda. Seperti terlihat pada gambar 18 bahwa isolat ID04-1071 memiliki kedekatan dengan spesies Actinoplanes rectilieneatus, Isolat ID04-1066, ID04-1052 dan ID04-1103 memiliki kedekatan dengan spesies Actinoplanes ferrugineus, dan isolat ID04-1067, ID04-1093 dan ID04-1088 memiliki kedekatan dengan spesies Actinoplanes globisporus.
Menurut Lechelavier & Lechelavier (1975) Actinoplanes rectilineatus memiliki morfologi hifa dan spora gram-positive, sporangia gram-negative, memiliki ukuran diameter 1,5 - 2,0 µm dan memiliki 17 hingga 40 flagella. Melalui analisis kemotaksonomi, Actinoplanes rectilineatus memiliki DAP berupa meso-DAP,tipe fosfolipid PII dan gula sel terdapat Xylose dan Arabinose.
Menurut Palleroni (1979) Actinoplanes ferrugineus memiliki sporangia dengan ukuran 4 – 12 µm dan koloni berwarna coklat. Melalui analisis kemotaksonomi didapatkan hasil analisis DAP berupa meso-DAP.
Menurut Wink (2015) Actinoplanes globisporus memiliki morfologi koloni berwarna kuning kejinggaan, memiliki sporangia dan permukaan spora halus.
Berdasaarkan Gambar 11 dapat terlihat angka disetiap cabang pohon filogenetik, angka tersebut menunjukkan berapa persen hasil dari repetasi bootsrap yang dihasilkan dari 1000 kali pengulangan. Hal ini berarti dari 1000 kali repetasi yang dilakukan melalui metode bootstrap, persen yang ditunjukkan akan menyatakan bahwa sepersekian kali kedekatan tersebut dihasilkan dalam pengulangan 1000 kali. Pada Gambar 11 juga ditunjukkan adanya skala yang menunjukkan jarak gen antar isolat.
Untuk mendukung data identifikasi isolat berdasarkan profil genetik, dalam penelitian kali ini dilakukan juga determinasi G+C content yang mampu