METODE PENELITIAN
C. Hasil Preparasi Sampel 1.Pengeringan 1.Pengeringan
Sampel herba selada air segar sebanyak 4,5 kg kemudian dicuci dengan air bersih yang mengalir tujuannya adalah untuk menghilangkan partikel-partikel asing dan kotoran yang terdapat pada selada air dan dikhawatirkan akan mengganggu dalam proses penelitian ini. Setelah sampel segar dicuci bersih kemudian dilakukan pemotongan menjadi beberapa bagian yang lebih kecil adapun tujuannya adalah lebih cepat dalam proses pengeringan karena akan memperluas luas kontak permukaan dari sampel tersebut setelah dilakukan pemotongan supaya proses pengeringan dapat berjalan lebih cepat karena air yang terdapat didalam sampel selada air dapat lebih cepat menguap karena adanya pemanasan.
Setelah itu sampel yang sudah dipotong-potong dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 400 C selama 2 hari. Penggunaan suhu 40 0C dilakukan supaya tidak merusak senyawa fenolik yang berpotensi sebagai antioksidan karena senyawa fenolik mudah rusak oleh adanya panas.
Tujuan dilakukan pengeringan adalah supaya kandungan air yang terdapat di dalam sampel dapat diuapkan sehingga mengurangi resiko terjadinya kontaminasi dari pertumbuhan bakteri, jamur ataupun organisme lain karena air merupakan salah satu media yang baik untuk pertumbuhan bakteri ataupun organisme hidup lainnya dan lebih mudah untuk dibuat dalam proses penyerbukan. Setelah kering herba yang sudah kering kemudian digiling dan kemudian dijadikan serbuk dan hasil yang didapatkan setelah penyerbukan adalah 151,1 g serbuk kering, jadi rendemennya sebesar 3,513 %.
2. Ekstraksi
Serbuk kemudian ditimbang dan dibagi menjadi tujuh sehingga berat masing- masing serbuk yang terbagi adalah 21,58 gram. Serbuk kemudian dilakukan maserasi dengan menggunakan pelarut etanol. Alasan diguanakannya pelarut etanol adalah sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh (Tevin, 2009) yang menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan dengan menggunakan metode DPPH dengan menggunakan pelarut etanol menunjukkan absorbansi yang lebih rendah dibandingkan dengan menggunakan pelarut air. Selain itu, penggunaan pelarut etanol bisa digunakan untuk mengambil senyawa polifenol yang terdapat pada tanaman karena dengan penggunaan cairan etanol pada proses maserasi dapat mengakibatkan enzim polifenil oksidase menjadi tidak aktif dan kemudian
senyawa polifenol akan keluar. Penggunaan pelarut etanol 70% yang digunakan dalam proses ekstraksi dengan menggunakan metode maserasi dikarenakan pelarut etanol 70% memiliki polaritas yang lebih tinggi dibandingkan dengan etanol murni yaitu 99- 100 % sehingga senyawa aktif bioflavonoid akan lebih banyak tertangkap pada konsetrasi etanol 70%. Etanol mudah memasuki ke dalam membran sel untuk mengekstraksi bahan-bahan intraseluler dari dalam sel seperti senyawa fenolik dan komponen organik lainnya ( Tiwari,et al, 2007).
Pada penelitian ini metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi tidak menggunakan metode ekstraksi lain yang menggunakan proses pemanasan seperti yang dilakukan dengan penyarian dengan alat Sokletasi, karena senyawa polifenol merupakan senyawa yang bersifat termolabil sehingga bila digunakan dengan penyarian menggunakan alat Sokletasi akan mengakibatkan rusaknya senyawa polifenol yang akan didapatkan. Begitu juga dengan menggunakan metode ekstrkasi dengan cara refluks, dan infundasi karena metode ini juga menggunakan proses pemanasan. Metode perkolasi tidak digunakan dalam penelitian ini karena metode ini memerlukan waktu yang cukup lama dan digunakan cukup banyak pelarut yang akan digunakan, selain itu metode ini juga hanya mendapatkan komponen yang diinginkan tidak terlalu banyak sehingga dipilih dengan metode maserasi.
Maserasi dilakukan selama dua hari dan dilakukan pada suhu kamar, tujuan dilakukannya ekstraksi dengan metode maserasi adalah untuk mendapatkan senyawa polfenol yang terdapat dalam sel tanaman, metode maserasi ini mengakibatkan dinding sel tumbuhan tersebut dapat pecah karena
terdapat gaya tekanan putar sehingga menyebabkan senyawa aktif bioflavonoid yang merupakan metabolit sekunder dapat keluar dari dalam sel menuju ke cairan pelarut. Pelarut etanol yang digunakan menyebabkan perbedaan tekanan osmotik di dalam dan diluar sel sehingga air masuk ke dalam sel tumbuhan dan menyebabkan zat aktif yang berada di dalam sel tumbuhan akan keluar, peristiwa tersebut akan terus berulang hingga terjadi keseimbangan antara larutan didalam sel dan didalam sel. Setelah dua hari perendaman kemudian untuk memisahkan antara ampas dengan pelarut dengan menggunakan corong Buchner dengan tujuan untuk memisahkan antara pelarut dengan serbuk, digunakan juga dengan bantuan pompa vakum untuk mempermudah proses ekstraksi
Sampel diremaserasi kembali dengan menggunakan pelarut etanol 70% selama dua hari dengan tujuan supaya jika masih ada metabolit sekunder yang masih belum tersari saat dilakukan maserasi yang pertama diharapakan dapat tersari pada maserasi yang kedua, kemudian setelah dua hari dipisahkan kembali antara pelarut dan serbuk dan kemudian dicampur dengan hasil masearsi yang pertama, selanjutnya untuk mendapatkan ekstrak etanolik yang kental digunakan
vaccum rotary evaporator yang berdasarkan prinsip kerjanya adalah berdasarkan perbedaan dari titik didih sehingga dapat memisahkan secara baik antara etanol dan zat filtrat. Selanjutnya, untuk filtrat yang sudah kental dikeringkan dengan cara dipanaskan di atas penangas uap sekitar suhu 40- 500 C digunakan suhu tidak terlalu tinggi dengan tujuan supaya tidak merusak senyawa fenolik yang bersifat termolabil. Ekstrak diuapkan dengan penangas air sampai didapatkan bobot tetap,
dari hasil itu didapatkan berat ekstrak etanolik kental sebesar 30,8629 g dengan rendemen sebesar 20,425% dihitung dari serbuk kering yang diperoleh.
3. Fraksinasi
Setelah didapatkan ekstrak etanolik yang kental, dilanjutkan dengan fraksinasi adapun tujuan dilkukannya fraksinasi adalah untuk mendapatkan komponen senyawa spesifik yang akan dicari. Pada penelitian ini senyawa yang dicari adalah senyawa fenolik yang terkandung dalam sel tanaman. Pelarut etanol yang digunakan dalam proses maserasi selain melarutkan senyawa fenolik tetapi selain itu juga dapat melarutkan senyawa organik lainnya yang tidak dikehendaki seperti lipid, klorofil dan senyawa organik lainnya, oleh karena itu untuk mendapatkan senyawa fenolik yang dituju perlu dilakukan fraksinasi.
Proses fraksinasi pada penelitian ini dilakukan dengan melarutkan sampel dari hasil ekstraksi yang menghasilkan ekstrak kental etanolik dengan menggunakan 300 ml air hangat dengan tujuan untuk melarutkan ekstrak etanolik yang sudah didapatkan supaya dapat dilakukan ekstraksi cair-cair. Pada ekstraksi cair-cair pada prinsipnya menggunakan dua macam pelarut yang berbeda yang nantinya akan digojog sehingga diharapkan senyawa yang dituju dapat terambil pada salah satu pelarut yang digunakan selama proses fraksinasi.
Setelah dilarutkan dengan air hangat, kemudian dilakukan fraksinasi dengan menggunakan pelarut wasbensin yang bersifat non polar. Tujuan dilakukan partisi dengan wasbensin adalah untuk menghilangkan senyawa non polar seperti klorofil lipid, asam organik , karotenoid yang secara alami terdapat
dalam sel tanaman ( Dai, et al, 2010). Selanjutnya campuran antara air dan wasbensin tersebut digojog dengan menggunakan corong pisah dengan tujuan supaya senyawa nonpolar dapat tertarik dari ke dalam fase wasbensin. Fraksi wasbensin berada di atas air hal tersebut disebabkan karena adanya perbedaan dari berat jenis antara kedua pelarut yang digunakan dalam fraksinasi itu. Adapun berat jenis untuk air 0,996 sedangkan berat jenis untuk wasbnesin adalah 0,730 (Anonim,1995). Fraksi air yang didapatkan kemudian digunakan kembali untuk dilakukan fraksinasi lagi dengan menggunakan etil asetat sedangkan fase wasbenin dibuang.
Proses fraksinasi pada penelitian dilakukan dengan 3 kali pemisahan yaitu masing-masing 100 ml untuk setiap kali melakukan fraksinasi, hal ini bertujuan supaya didapatkan hasil fraksinasi yang optimal karena menurut hukum Nerst koefisen distribusi (KD) merupakan perbandingan antara zat terlarut di dalam kedua pelarut yang tidak saling campur yang nantinya akan berpindah karena terjadi kejenuhan dan berdistribusi ke salah satu pelarut karena perbedaan kepolarannya, sehingga untuk mendapatkan hasil yang baik diperlukan beberapa kali proses fraksinasi.
Setelah didapatkan fraksi air selanjutnya dilakukan fraksinasi lagi dengan, menggunakan etil asetat, digunakan etil asetat karena penggunaan etil asetat dapat adalm proses fraksinasi akan mengakibatkan senyawa –senyawa aktif yang terdapat dalam sel tanaman dapat berpindah dari fase air menuju ke faseetil asetat, senyawa aktif yang dapat larut ke dalam fase etil asetat yang
memiliki sifat semi-polar. Salah satu senyawa fenolik yang dapat tertarik masuk ke dalam fraksi etil asetat adalah flavonoid.
Fraksinasi dengan menggunakan fraksi etil asetat juga untuk memisahkan bentuk glikon (terikat dengan gula) dan aglikonnya (bentuk tidak terikat dengan gula), sedangkan senyawa lain yang masuk ke dalam fraksi air adalah senyawa fenolik yang bersifat polar dan dalam bentuk aglikon. Pada penelitian ini yang diambil adalah fraksi dari etil asetat, dalam corong pisah fraksi etil asetat akan berada di bagian bawah sedangkan fraksi air akan berada di bagian atas hal ini disebabkan karena perbedaan dari berat jenis. Berat jenis untuk air adalah 0,996 sedangkan berat jenis untuk etil asetat adalah 0,898 (Anonim, 1995).
Setelah dilakukan pemisahan dengan menggunakan corong pisah didapatkan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air kemudian dipekatkan dengan menggunakan vaccum rotary evaporator, setelah didapatkan ekstrak kental fraksi etil asetat ekstrak etanolik setelah bobot tetap adalah 1,3043 g, kemudian ekstrak kental disimpan di dalam desikator dengan ditutup aluminium foil dengan tujuan supaya terhindar dari cahaya matahari secara langsung yang dikhawatirkan dapat merusak senyawa fenolik yang berpotensi sebagai antioksidan sehingga mempengaruhi hasil dalam penelitian.
D.Hasil Uji Pendahuluan 1. Uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik total
Uji pendahuluan ini bertujuan untuk melihat ada atau tidaknya kandungan senyawa fenolik yang terdapat pada fraksi etil asetat ekstrak etanolik
dari herba selada air. Uji pendahuluan yang digunakan pada penelitian ini menggunakan metode yang digunakan adalah dengan metode Folin-Ciocalteu. Metode ini akan mengakibatkan terjadinya reduksi dari ion fenolat dan senyawa lain yang bisa tereduksi, sehingga akan terjadi perubahan warna menjadi biru pada susana yang basa.
Pada uji pendahuluan ini untuk melihat adanya kandungan senyawa fenolik yang terdapatr pada sampel, dilakukan tiga tabung yang berisi kontrol positif, kontrol negatif dan sampel. Kontrol positif yang berisi reagen Folin-Ciocalteu, larutan natrium karbonat 1M dan larutan pembanding asam galat dengan konsentrasi 100 µg/ml, sedangkan kontrol negatif yang berisi reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat dan sampel yang berisi larutan sampel dengan konsentrasi 500 µg/ml, selanjutnya ditambahkan dengan reagen kontrol negatif yang berisi reagen Folin-Ciocalteu, larutan Na2CO3 dan larutan metanol p.a. : air (1:1). Kemudian didiamkan selama 30 detik dan diamati perubahan warna yang terjadi.
Gambar 4. Uji pendahuluan kandungan senyawa fenolik total
Keterangan : tabung A ( fraksi etil asetat + Folin-Ciocalteu + Na2CO3), tabung B (asam
Setelah dilakukan pengamatan dapat dilihat bahwa terjadi perubahan warna menjadi biru tua pada kontrol positif dan terjadi pula perubahan warna menajdi biru yang terdapat pada larutan uji, tetapi tidak terjadi perubahan warna pada kontrol negatif. Hal ini dapat disimpulkan bahwa sampel uji mengandung senyawa fenolik yang dibuktikan dengan terajdinya perubahan warna menjadi biru karena terjadi proses reduksi oleh reagen Folin-Ciocalteu pada suasana yang basa.
2.Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Uji pendahuluan ini bertujuan untuk melihat ada atau tidaknya aktivitas antioksidan yang terdapat pada fraksi etil asetat ekstrak etanolik dari herba selada air . Metode uji pendahuluan yang dilakukan pada penelitian ini termasuk ke dalam metode kualitatif karena hanya dilakukan pengamatan. Uji pendahuluan antioksidan akan memberika hasil positif yang ditandai dengan berubahnya warna DPPH dari ungu tua menjadi kekuningan hal ini dapat disebabkan karena terjadi penguarangan aktivitas dari radikal DPPH karena ditangkap oleh senyawa yang berpotensi sebagai antioksidan sehingga terbentuk senyawa DPPH yang tereduksi.
Pada uji ini disiapkan 3 tabung reaksi yang berisi kontrol positif yang berisi larutan rutin dengan konsentrasi 20 µg/ml dan larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM, kontrol negatif yang kemudian hanya berisi larutan DPPH 0,4 mM tanpa diberi larutan rutin dan sampel dan hanya ditambah dengan pelarut metanol p.a. Kemudian untuk sampel yang berisi larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air dengan konsentarsi 400 µg/ml.
Gambar 5. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Keterangan : tabung A ( DPPH + metanol p.a.), tabung B ( fraksi etil asetat
ekstrak etanolik + DPPH + metanol p.a. dan tabung C ( rutin + DPPH + metanol
p.a.)
Dari ketiga perlakuan tersebut dibandingkan warna ketiga larutan tersebut setelah didiamkan selama 30 detik. Dari hasil percobaan didapatkan bahwa terjadi perubahan warna untuk kontrol positif yaitu dari warna ungu menjadi kuning begitu juga dengan larutan uji yang berisi sampel dan DPPH akan tetapi tidak terjadi perubahan warna pada kontrol negatif yang berisi larutan DPPH dan metanol p.a. kemudian dapat disimpulkan bahwa terdapat aktivitas antioksidan yang terdapat dalam sampel yang ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna menjadi kuning seperti yang terjadi pula pada kontrol positif.
E.Hasil Optimasi Penetapan Kandungan Fenolik Total