Abstrak
Embriogenesis somatik kopi Arabika (Coffea arabica L.) masih terkendala dalam meregenerasikan planlet dari eksplan yang dikulturkan. Kemampuan eksplan daun membentuk embrio dalam embriogenesis somatik kopi sangat dipengaruhi oleh komposisi media dan zat pengatur tumbuh. Penelitian bertujuan untuk mempelajari pembentukan kalus embriogenik, pendewasaan dan perkecambahan kopi Arabika dengan menggunakan 2,4-D dan benzyl amino purine (BAP). Bahan tanaman yang digunakan adalah daun kopi Arabika varietas S 795 koleksi Balai Penelitian Tanaman Industri dan Penyegar (Balittri). Rancangan perlakuan menggunakan rancangan acak lengkap dengan 6 ulangan, masing-masing ulangan terdiri dari 5 eksplan. Induksi kalus menggunakan 5 kombinasi perlakuan 2,4-D 4.54 µM + BAP 0 µM; 2,4-D 4.54 µM + BAP 4.44 µM; 2,4-D 4.54 µM + BAP 8.88 µM ; 2,4-D 9.04 µM + BAP 4.44 µM ; dan kontrol (tanpa penambahan 2,4-D dan BAP). Peubah yang diamati meliputi ; persentase kalus embriogenik, berat basah kalus, jumlah pro embrio dan kecambah. Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua media perlakuan membentuk kalus kecuali perlakuan kontrol. Berat kalus, persentase kalus embriogenik, dan jumlah pro embrio tertinggi diperoleh pada media kombinasi 2,4-D 9.04 µM + BAP 4.44 µM. Kalus embriogenik dari eksplan daun yang mampu beregenerasi melalui jalur embriogenesis somatik berasal dari media kombinasi 2,4-D 4.54 µM + BAP 8.88 µM dengan persentase 16.67% dengan 6 kecambah per 0.2 g kalus.
Kata Kunci: Coffea arabica L., 2,4-D, benzyl amino purine, eksplan
---
Catatan : Sebagian dari bab ini telah dipublikasikan pada Buletin RISTRI Vol.4 No. 2. Halaman 91-98. Juli 2013.
3. EMBRYOGENIC CALLUS INDUCTION AND
REGENERATION POTENTIAL OF ARABICA COFFEE
Abstract
Somatic embryogenesis of Arabica coffee (Coffee arabica L.) is still challenging in regenerating plantlets from cultured explants. The ability of leaf explants to generate embryos in somatic embryogenesis of coffee is most influenced by the composition of media and plant growth regulators (PGR). The research aims to study the formation of embryogenic callus, maturation and germination of Arabica coffee using 2,4-D and benzyl amino purine (BAP). Plant material used was leaves of S 795 variety from germplas collection of Indonesian Industrial and Beverage Crops Research Institute. The research was arranged in completely randomized design with six replications; each replication contained five explants. Callus induction media consisted of five treatments 2,4-D 4.54 µM + BAP 0 mg L-1; 2,4-D 4.54 µM + BAP 4.44 µM ; 2,4-D 4.54 µM + BAP 8.88 µM; 2,4-D 9.04 µM + BAP 4.54 µM and control (without 2,4-D and BAP). Parameters observed were number of callus, percentage of embryogenic callus, callus fresh weight, number of pro-embryo and number of germinate embryos. Result showed that all treatments could form callus except for control. The highest of callus fresh weight, embryogenic callus percentage, and number of pro-embryo were obtained from media combination of 2,4-D 9.04 µM and BAP 4.44 µM. Embryogenic callus from leaf explant capable of regenerating was derived from media combination 2,4-D 4.54 µM and BAP 8.88 µM with embryogenic callus percentage of 16.67% and number of germinate embryos was 6 per 0.2 g of callus.
Keywords : Coffea arabica L., 2,4-D, benzyl amino purine, explant
--- Note : Section of chapter has been published in Buletin RISTRI Vo.4.No.2. pages 91-98. July 2013.
Pendahuluan
Kopi Arabika (Coffea arabica L.) merupakan tanaman perkebunan yang dapat diperbanyak secara generatif dengan menggunakan biji dan vegetatif menggunakan stek, okulasi dan sambung pucuk. Perbanyakan menggunakan biji tidak menjamin benih yang dihasilkan akan sama dengan induknya, karena walaupun tanaman kopi menyerbuk sendiri masih ada peluang terjadinya penyerbukan silang. Perbanyakan vegetatif menghasilkan bibit yang sama dengan induknya, tetapi tidak semua cabang kopi dapat digunakan sebagai sumber bahan tanaman, sehingga bibit yang dihasilkan terbatas.
Teknik kultur jaringan memberikan alternatif dalam perbanyakan bibit kopi. Teknik ini memungkinkan untuk memproduksi bibit yang relatif seragam dalam skala besar, dengan waktu yang lebih singkat, dan bebas hama penyakit. Berbagai pendekatan yang telah dipertimbangkan untuk perbanyakan kultur jaringan kopi, diantaranya; organogenesis (menggunakan tunas adventif dan aksilar), microcutting, dan embriogenesis somatik (Santana-Buzzy et al. 2007; Andrés et al. 2008).
Embriogenesis somatik merupakan suatu proses di mana sel-sel somatik berkembang membentuk tanaman baru melalui tahapan perkembangan embrio yang spesifik tanpa melalui fusi gamet (Williams & Maheswara, 1986). Kesamaan tahapan embriogenesis somatik dan zigotik telah digambarkan oleh Zimmerman (1993). Benih dengan struktur yang bipolar dan kondisi fisiologis yang menyerupai embrio zigotik menyebabkan perbanyakan melalui pembentukan embrio somatik lebih menguntungkan daripada pembentukan tunas adventif, tunas aksilar dan meristem yang unipolar.
Perbanyakan melalui embriogenesis somatik dari berbagai jenis eksplan telah dilakukan dengan menggunakan anther, meristem, biji, hipokotil, epikotil, akar, dan daun. Hasil penelitian memperlihatkan bahwa penggunaan eksplan daun kopi paling responsif dalam menghasilkan embrio somatik dibandingkan bagian tanaman yang lain (Carneiro 1999; Oktavia et al. 2003). Penggunaan eksplan daun pada kopi Arabika dalam embriogenesis somatik telah banyak dilakukan, diantaranya oleh Etienne et al. (2002), Quiroz-Figueroa et al. (2002), Priyono (2004), dan Albarra´n et al. (2005).
Penelitian perbanyakan tanaman kopi melalui embriogenesis somatik telah banyak dilaporkan diantaranya dari penelitian Carneiro (1999), Etienne et al. (2002), Quiroz-Figueroa et al. (2002), Oktavia et al. (2003), Priyono (2004), Giridhar et al. (2004), Albarra´N et el. (2005), Samson et el. (2006), dan Arimarsetiowati (2011). Perbanyakan melalui embriogenesis somatik yang diaplikasikan dengan bioteknologi bukan hanya dapat digunakan untuk perbanyakan, tetapi juga untuk memperbaiki karakter tanaman. Hal ini menjadikan penelitian embriogenesis somatik menjadi penting.
Zat pengatur tumbuh 2,4-D merupakan auksin yang paling umum digunakan untuk menginduksi embriogenesis somatik. Auksin NAA dan IBA baik secara tunggal maupun dikombinasikan dengan 2,4-D juga dapat digunakan untuk menginduksi embriogenesis somatik. Selain auksin, beberapa jenis sitokinin yang biasa dikombinasikan dengan auksin untuk menginduksi embrio somatik diantaranya adalah BA, Kinetin, Thidiazuron dan 2-iP (George & Sherington 1984; Wattimena et al. 1992).
Penelitian embriogenesis somatik kopi Arabika menggunakan kombinasi zat pengatur tumbuh 2,4-D, Benzyl Amino Purine (BAP), dan Naphtalene Acetic Acid (NAA) telah dilakukan oleh Neuenschwander dan Baumann (1992). Priyono dan Danimihardja (1991) menggunakan BAP dan kinetin. Priyono (1993) menggunakan Indole Asetic Acid (IAA), BAP dan Adenine sulfat. Penelitian mengunakan 2,4-D dan BAP tanpa penambahan ZPT lainnya pada kultur kopi Arabika belum pernah dilaporkan. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pembentukan kalus embriogenik, pendewasaan dan perkecambahan kopi Arabika (Coffea arabika L.) dengan menggunakan 2,4-D dan BAP.
Bahan dan Metode
Penelitian dilakukan di laboratorium kultur jaringan tanaman dan rumah kaca, Unit Pengembangan Benih Unggul Pertanian, Juli 2011 sampai Desember 2012. Bibit tanaman yang digunakan sebagai sumber eksplan adalah bibit yang ditumbuhkan dan dipelihara dirumah kaca.
- Induksi Kalus Embriogenik Kopi Arabika
Media dasar yang digunakan adalah media Murashige dan Skoog (MS) dengan 1/2 konsentrasi garam makro dan mikro yang dilengkapi vitamin B5, sukrosa 30 g L-1, dan 250 mg L-1 polivynil pyrolidon (PVP). Zat pengatur tumbuh 2,4-D dan BAP ditambahkan pada media dengan kombinasi perlakuan 2,4-D 0 µM + BAP 0 µM (kontrol); 2,4-D 4.52 µM + BAP 0 µM ; 2,4-D 4.52 µM + BAP 4.44 µM ; 2,4-D 4.52 µM + BAP 8.88 µM; dan 2,4-D 9.04 µM + BAP 4.44 µM. Media dipadatkan menggunakan gel gum 3 g L-1. Sterilisasi media menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 20 menit dengan tekanan 1.5 atm.
Daun muda yang sudah membuka sempurna dari varietas S 795 dipetik dan dibersihkan dengan air mengalir. Daun direndam dalam fungisida yang berbahan aktif Mankozeb 80 %dengan konsentrasi 0.2% selama 1 jam, lalu dibilas sampai bersih. Daun dibawa ke dalam laminar air flow. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan alkohol 70% selama 3 menit dan sodium hipoklorit 10% selama 15 menit, kemudian daun dibilas sampai bersih menggunakan aquadest steril. Daun steril dipotong-potong dengan ukuran ± 1 cm x 1 cm, lalu dikulturkan pada media kultur sesuai dengan perlakuan yang diuji. Botol kultur yang berisi eksplan diinkubasi di ruang gelap pada temperatur ± 25 oC dengan kelembaban relatif ± 60%. Kalus embriogenik yang terbentuk dipisahkan dari daun, kemudian dilakukan subkultur ke media yang sama dengan cara menimbang 0.2 g kalus per botol. Botol diinkubasi kembali di ruang gelap pada temperatur ± 25 oC dengan kelembaban relatif ± 60%.
- Regenerasi Kalus Embriogenik Kopi Arabika
Kalus embriogenik di subkultur ke media MS dengan 1/2 konsentrasi garam makro dan mikro yang dilengkapi vitamin B5. Media ditambahkan sukrosa 30 g L-1, 250 mg L-1 Polivynil Pyrolidon (PVP), dan kinetin 9.30 µM. Kecambah yang terbentuk di subkultur ke media MS dengan 1/2 konsentrasi garam makro dan mikro yang dilengkapi vitamin B5, sukrosa 30 g L-1 tanpa pemberian ZPT. Botol diinkubasi dalam ruang terang dengan penyinaran selama 16 jam, intensitas penyinaran 1000-1500 luks, temperatur ± 25 oC dan kelembaban relatif ± 60%.
- Analisis Statistik
Rancangan perlakuan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap dengan 6 ulangan. Satu ulangan terdiri dari 5 eksplan daun. Uji lanjut dilakukan dengan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf uji 5%.
Hasil dan Pembahasan - Induksi Kalus Embriogenik Kopi Arabika
Tepi daun kopi mulai terlihat membengkak setelah tiga minggu di media perlakuan. Pada minggu ke empat, pengkalusan di bagian bekas sayatan mulai terbentuk pada media kombinasi 2,4-D 9.04 µM + BAP 4.44 µM dan 2,4-D 4.52 µM + BAP 8.88 µM, dan minggu berikutnya pada perlakuan yang lain kecuali pada perlakuan tanpa penambahan ZPT (Kontrol) (Gambar 2A). Pemberian ZPT terlihat sangat berperan dalam pembentukan kalus. Hal yang sama dilaporkan oleh Ibrahim et al. (2012), dimana perlakuan 2,4-D dan kinetin pada kopi Arabika mampu menghasilkan kalus, kecuali perlakuan kontrol.
Pembentukan kalus terlihat semakin meningkat seiring dengan bertambahnya waktu. Dua bulan dalam media induksi, kalus yang terbentuk hanya disekitar bekas sayatan saja (Gambar 2B). Hal ini juga dijumpai pada penelitian Oktavia et al. (2003) dimana kalus hanya terbentuk dibekas luka sayatan. Hal ini berbeda dengan hasil penelitian Priyono (1993) yang berhasil mendapatkan kalus dan embrio somatik pada permukaan maupun sisi daun. Perbedaan ini diduga karena ada perbedaan ukuran eksplan yang digunakan, perbedaan konsentrasi dan jenis ZPT yang ditambahkan ke media inisiasi kalus, lamanya inisiasi, serta perbedaan respon dari genotipe tanaman yang digunakan sehingga tanggap jaringan juga berbeda.
Secara morfologi kalus yang terbentuk tidak semuanya embriogenik. Hasil analisis statistik menunjukkan persentase pembentukan kalus embriogenik masih rendah, yaitu di bawah 50% (Gambar 3), walaupun ada beberapa dari ulangan pada kombinasi perlakuan 2,4-D 4.53 µM dan BAP 8.88 µM pembentukan kalus embriogenik ada yang mencapai 90% (data tidak ditampilkan).
Berdasarkan warna kalus kopi yang terbentuk, kalus dapat dikelompokkan menjadi tiga kelompok, yaitu kalus yang berwarna kekuningan, putih kekuningan, dan putih. Kalus berwarna kekuningan dan putih kekuningan merupakan kalus embriogenik, sementara kalus yang berwarna putih merupakan kalus non embriogenik. Kalus non embriogenik biasanya tidak mempunyai kemampuan untuk beregenerasi sehingga dalam proses subkultur tidak diikut sertakan (Gambar 4A). Kalus embriogenik merupakan kalus yang diharapkan mampu berkembang menjadi embrio somatik. Kalus kopi dengan tiga warna yang sama juga dilaporkan pada penelitian Riyadi dan Tirtoboma (2004) yang menggunakan kopi Arabika varietas Kartika, pada media Murashige-Skoog standar yang mengandung 30 g L-1 sukrosa serta diberi 2,4-D dan kinetin.
Pengamatan mikroskopik pada umur kultur 2 bulan, di samping terbentuknya kalus juga ditemukan adanya massa pro embrio. Pro embrio terlihat di bagian bawah dari daun yang berdekatan dengan bagian sayatan dengan warna putih dan permukaan yang licin (Gambar 4C). Massa pro embrio yang dihasilkan tersebut mempunyai potensi untuk dikembangkan menjadi embrio globular, namun massa pro embrio yang dihasilkan jumlahnya tidak seperti yang diharapkan.
Gambar 2. Perkembangan pembentukan kalus kopi Arabika pada media induksi dengan perlakuan kombinasi 2,4-D 9.04 µM+ BAP 4.44 µM. (A). Empat minggu setelah induksi kalus, dan (B). Dua bulan setelah induksi kalus.
Gambar 3. Persentase kalus embriogenik kopi Arabika yang terbentuk 2 bulan setelah eksplan dikulturkan pada media induksi kalus. Huruf yang sama di atas grafik tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan α = 0.05.
Hasil analisis statistik memperlihatkan bahwa pemberian 2,4-D secara tunggal tanpa dikombinasikan dengan BAP menghasilkan jumlah pro embrio lebih sedikit jika dibandingkan ketika dikombinasikan dengan BAP. Jumlah pro embrio terbanyak dijumpai pada perlakuan kombinasi 2,4-D 9.04 µM+ BAP 4.44 µM. Grafik memperlihatkan terjadinya kenaikan jumlah pro embrio yang dihasilkan sehingga masih dimungkinkan untuk meningkatkan konsentrasi zat pengatur tumbuh yang digunakan (Gambar 5).
A
A
Gambar 4. Keragaan kalus kopi Arabika. A-B. Kalus embriogenik (E) dan tidak embriogenik (NE) (Tanda panah). C. Pro embrio kopi Arabika pada media induksi kalus (Tanda panah) di bawah mikroskop elektron.
Gambar 5. Jumlah pro embrio kopi Arabika yang terbentuk pada saat 2 bulan setelah eksplan dikulturkan pada media induksi kalus. Huruf yang sama di atas grafik tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan α = 0.05.
Chaudhury dan Qu (2000) menyatakan bahwa auksin dan sitokinin yang diberikan bersama-sama dapat menstimulasi terbentuknya kalus embriogenik, akan tetapi diperlukan rasio tertentu dari kombinasi keduanya untuk menginduksi pembentukan embrio somatik. Hal ini sesuai dengan penelitian sebelumnya yang melaporkan bahwa ketika jaringan eksplan kopi Arabika ditempatkan di media nutrisi yang mengandung zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin, sel-sel somatik melakukan proses dediferensiasi membentuk kalus dan massa pro embrio (Neuenschwander & Baumann 1992; Riyadi & Tirtoboma 2004; Samson et al. 2006; Mene´ndez-Yuffa´ et al. 2010). Jumlah embrio dalam embriogenesis somatik dapat ditingkatkan, selain memperhatikan keseimbangan zat pengatur tumbuh, perlu mengatur keseimbangan ammonium (N) dari N tereduksi serta N teroksidasi, mengatur konsentrasi sumber energi, dan asam amino (Gray 2005).
Berdasarkan analisis statistik, bobot kalus perlakuan kombinasi 2,4-D 9.04 µM + BAP 4.44 µM menghasilkan kalus terberat dengan rataan 0.16 g. Gambar 6 memperlihatkan berat kalus bertambah dengan meningkatnya konsntrasi 2,4-D, sementara pemberian 2,4-D tanpa BAP kalus yang terbentuk lebih sedikit. Hal ini terjadi karena tipe morfogenesis pada kultur jaringan sangat tergantung pada rasio antara auksin dan sitokinin yang diberikan. Kalus akan terbentuk jika terdapat rasio auksin terhadap sitokinin yang lebih tinggi. Konsentrasi auksin dan sitokinin yang berbeda mengakibatkan arah pertumbuhan yang berbeda sekalipun rasionya dalam jumlah yang sama (George & Sherrington 1984; Tores 1989).
Kalus dan pro embrio yang terbentuk setelah 2 bulan disubkultur ke media yang sama. Pro embrio yang terbentuk menjadi kalus kembali setelah 1 bulan disubkultur. Warna kalus yang tadinya putih kekuningan berubah menjadi kuning kecokelatan pada 2 bulan setelah disubkultur.
Regenerasi Kalus Embriogenik Kopi Arabika
Kalus yang terbentuk kemudian di subkultur ke media yang diberi zat pengatur tumbuh kinetin 9.30 µM. Dua bulan di media ini pada perlakuan kombinasi 2,4-D 4.52 µM dan BAP 8.88 µM kalus yang berwarna cokelat kehitaman timbul bintik-bintik putih yang menandakan mulai terbentuknya embrio somatik. Apabila dilihat di bawah mikroskop elektron bintik putih tersebut merupakan kalus yang memasuki fase globular (Gambar 7A).
Globular yang terbentuk akan berkembang menjadi hati, torpedo (Gambar 7B) dan kotiledonari. Embrio fase kotiledonari kemudian ditumbuhkan sampai menjadi planlet di media MS tanpa pemberian zat pengatur tumbuh. Hal ini sesuai dengan pernyataan George dan Sherrington (1984) dan Evans et al. (1981) yang menyatakan bahwa awal dari proses embriogenesis somatik dimulai dengan terbentuknya tonjolan membulat, yang biasanya muncul dari eksplan atau kalus. Perkembangan embriogenesis somatik yang normal akan melalui tahapan pro embrio, globular, bentuk hati, torpedo, kotiledonari dan planlet.
Gambar 6. Bobot basah kalus kopi Arabika yang terbentuk pada saat 2 bulan setelah eksplan dikulturkan pada media induksi kalus. Huruf yang sama di atas grafik tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan α = 0.05
Gambar 7. Keragaan kecambah kopi Arabika yang terbentuk melalui proses embriogenesis somatik. (A) Globular (tanda panah). (B) Torpedo. dan (C) Planlet.
Gambar 8. Jumlah kecambah kopi Arabika yang terbentuk pada saat 10 bulan di media regenerasi.
Hasil pengamatan terhadap jumlah embrio somatik yang mampu berkecambah hanya berasal dari media kombinasi 2,4-D 4.52 µM dan BAP 8.88 µM dengan persentase 16.67 %. Jumlah kecambah yang terbentuk per 0.2 g kalus sebanyak 6 buah (Gambar 8). Planlet yang terbentuk terlihat normal dengan hipokotil, daun, dan akar tunggang (Gambar 7C).
Simpulan
Kalus embriogenik berhasil diinduksi dari eksplan daun kopi Arabika. Perlakuan 2,4-D 4.52 µM + BAP 0 µM; 2,4-D 4.52 µM + BAP 4.44 µM; 2,4-D 4.52 µM+ BAP 8.88 µM; dan 2,4-D 9.04 µM + BAP 4.44 µM dapat membentuk kalus kecuali perlakuan kontrol. Berat kalus, persentase kalus embriogenik, dan jumlah pro embrio tertinggi diperoleh pada media kombinasi 2,4-D 8.88 µM dan BAP 4.44 µM. Kalus yang mampu beregenerasi berasal dari media kombinasi 2,4-D 4.52 µM dan BAP 8.88 µM dengan persentase 16.67 % dengan jumlah kecambah sebanyak 6 buah per 0.2 g kalus.
Daftar Pustaka
Albarra´n J, Bertrand B, Lartaud M, Etienne H. 2005. Cycle characteristics in a temporary immersion bioreactor affect regeneration, morphology, water, and mineral status of coffee (Coffea arabica) somatic embryos. Plant Cell Tissue Organ Culture 81: 27–36.
Andrés M, Gatica-Arias AM, Arrieta-Espinoza G, Esquivel AME. 2008. Plant regeneration via indirect somatic embryogenesis and optimisation of genetic transformation in Coffea arabica L. cvs. Caturra and Catuaí. Pontificia Universidad Católica de Valparaíso–Chile. 11(1): 1-9.
Arimarsetiowati R. 2011. Pengaruh Auksin 2,4-D dan Sitokinin 2-iP Terhadap Pembentukan Embriogenesis Somatik Langsung Pada Eksplan Daun Coffea arabica L. Pelita Perkebunan. 27(2) : 68-77.
Carneiro M F. 1999. Advences in coffee biotechnology. AgBiotechnet 1: 1-7. Chaudhury A, Qu. R. 2000. Somatic embryogenesis and plant regeneration of turf
type nermudagrass: Effect of 6-benzyladenine in calli induction medium. Plant Cell Tissue organ. Cult. 60: 113-120.
Etienne H, Anthony F, Dussert S, Fernandez D, Lashermes P, Bertrand B. 2002. Biotechnological applications for the improvement of coffee (Coffea arabica L.). In Vitro Cellular and Developmental Biology. 38:129-138. Evans DA, Sharp WA, Flick CE. 1981. Growth and behavior of cell cultures. In
Embryogenesis and Organogenesis in Pant Tissue Culture: Methods and Application in Agriculture (Thorpe, T.A ed). New York (US). Academic Press. p. 45-59.
George FF, Sherrington PD. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. England (GB). Exegetic Ltd. 709p.
Giridhar P, Kumar V, Indu EP, Ravishankar, Chandrasekar A. 2004. Thidiazuron induced somatic embryogenesis in Coffea arabica L. and Coffea canephora P ex Fr. Acta Botanica Croatica. 63 (1): 25-33.
Gray DJ. 2005. Propagation from Nonmeristematik Tissue Culture: Non Zygotic Embryogenesis. In Trigano, R.N. and D. J. Gray (Eds). New York (US). RCR Press. LLC. hlm187-200.
Ibrahim MSD, Sudarsono, Rubiyo, Syafaruddin.2012. Pengaruh komposisi media terhadap pembentukan kalus menuju induksi embrio somatik kopi Arabika (Coffea arabica). Buletin Riset Tanaman Rempah dan Aneka Tanaman Industri 3 (1): 13-22.
Mene´ndez-Yuffa A, Dominique Barry-Etienne D, Bertrand B, George F, Etienne H. 2010. A comparative analysis of the development and quality of nursery plants derived from somatic embryogenesis and from seedlings for large- scale propagation of coffee (Coffea arabica L.). Plant Cell Tiss Organ Cult 102: 297–307.
Neuenschwander B, Baumann TW. 1992. A novel type of somatic embryogenesis in Coffea arabica. Plant Cell Rep. 10: 608-612.
Oktavia F, Siswanto, Budiani A, Sudarsono. 2003. Embriogenesis somatik langsung dan regenerasi planlet kopi Arabika (Coffea arabica) dari berbagai eksplan Menara Perkebunan 71 (2): 44-55.
Priyono, Danimihardja S. 1991. Reproduksi embrio somatik kopi Arabika dengan menggunakan BAP dan Kinetin serta regenerasi planlet dengan menggunakan Ca-P dan biotin. Dalam Prosiding Seminar Bioteknologi Perkebunan dan Lokakarya Biopolimer Untuk Industri. Pusat Antar Universitas IPB. Bogor (ID). 10-11 Desember 1991.
Priyono. 1993. Embriogenesis somatik langsung pada kultur in vitro eksplan daun kopi Arabika (Coffea arabica). Jurnal Pertanian Indonesia. 3(l): 16-20. Priyono. 2004. Kultur in vitro daun kopi untuk mengetahui kemampuan
embriogenesis somatik beberapa varietas kopi. Pelita Perkebunan 20 (3): 110-122.
Quiroz-Figueroa FR, Fuentes-Cerda CFJ, Rojas-Herrera R, Loyola-Vargas VM. 2002. Histological studies on the developmental stages and differentiation of two different somatic embryogenesis systems of Coffea arabica. Plant Cell Reports. 20:1141–1149.
Riyadi A. Tirtoboma. 2004. Pengaruh 2,4-D terhadap induksi embrio somatik kopi Arabika. Buletin Plasma Nutfah 10 (2): 82-89.
Samson NP, Campa C, Le Gal L, Noirot M, Thomas G, Lokeswari TS, Kochko A.de. 2006. Effect of primary culture medium composition on high frequency somatic embryogenesis in different Coffea species. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 86:37-45.
Santana-Buzzy,N, Rojas-Herrera R, Galaz-Ávalos RM, Ku-Cauic JR, Mijangos- Cortés J, Gutierrez-Pache LC, Canto A, Quiroz-Figueroa F, Loyala-Vatgas VM. 2007. Advances in coffee tissue culture and its practical applications. In Vitro Cellular & Developmental Biology 43: 507-520.
Tores KC. 1989. Tissue Culture Techniquest for Horticultural Crops. Van Nostrand Reinhold. New York (US). 285 hlm.
Wattimena GA, Gunawan LW, Mattjik NA, Syamsudin E, Wiendi NMA, Ernawati A. 1992. Bioteknologi Tanaman. Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Pusat antar Universitas Bioteknologi. IPB. 309 hlm. Williams EG, Maheswara. 1986. Somatic embryogenesis factors influencing
coordinated behaviour of cells as on embryogenic group. Ann. Bot. 57: 443- 462.
Zimmerman JL. 1993. Somatic embryogenesis : A. model for early development in higher plants. The Plant Cell. 5: 1411-1423.