B. PENELITIAN UTAMA
2. Kadar Dekstran Terdegradasi
Analisa kadar dekstran pada penelitian ini dilakukan melalui pendekatan kadar dekstran terdegradasi yang dinyatakan sebagai gula pereduksi produk degradasi dekstran dalam nira tebu (STTH). Menurut Johnson (1991), aktivitas dekstranase dapat diuji dengan menentukan gula pereduksi yang dibebaskan selama inkubasi campuran reaksi.
Namun menurut Apriantono et al. (1989), metode Schaffer-Somogy dan metode DNS tidak spesifik karena akan mengukur seluruh senyawa pereduksi. Pada kondisi tersebut, penggunaan sampel kontrol dianggap penting untuk mengatasi bias pembacaan gula pereduksi hasil aktivitas mikroorganisme lain yang hidup dalam nira dan gula pereduksi hasil degradasi dekstran. Selisih kadar gula pereduksi dari keduanya merupakan
gula pereduksi dari proses degradasi dekstran oleh dekstranase yang diperoleh melalui pegurangan total gula dengan gula pereduksi, kemudian membandingkannya dengan sampel control untuk menghilangkan bias pembacaan kadar dekstran terdegradasi.
Hasil perhitungan kadar gula pereduksi nira tersaji pada Lampiran 8. Kadar dekstran terdegradasi dari keseluruhan proses degradasi dekstran dalam nira bervariasi berkisar 0-2,453 mg/ml dengan rata-rata 0,307 mg/ml. Rata-rata kadar dekstran terdegradasi pada berbagai kombinasi perlakuan selama degradasi dekstran dalam nira disajikan pada Gambar 20.
Terlihat semua sampel yang ditambahkan dekstranase dibandingkan dengan sampel kontrol (dosis 0 UD/l Nira) mengalami peningkatan kadar dekstran terdegradasi dan menurun kadar dekstran terdegradasinya dengan semakin lamanya inkubasi. Kondisi ini sesuai dengan hasil analisis sidik ragam pada Lampiran 9 yang menunjukkan perlakuan dosis enzim dan lama inkubasi, serta interaksi keduanya berpengaruh nyata terhadap kadar dekstran terdegradasi.
Semakin tinggi dosis enzim cenderung menyebabkan laju degradasi dekstran semakin rendah. Pada tingkat penambahan dosis terkecil (dosis 80 UD/l nira), proses kesetimbangan reaksinya telah optimum dibandingkan Gambar 20. Grafik Kadar Dekstran Terdegradasi Nira pada Berbagai Kombinasi Perlakuan Dosis Dekstranase dan Lama Inkubasi
penambahan dosis 100 dan 120 UD/l nira. Berdasarkan uji lanjut Duncan pengaruh interaksi keduanya terhadap kadar dekstran terdegradasi pada tingkat kepercayaan 95 % (Lampiran 10) diperoleh kombinasi perlakuan terbaik dengan rata-rata kadar dekstran terdegradasi tertinggi adalah kombinasi dosis 80 UD/l nira dan lama inkubasi 30 menit yang berbeda nyata dengan kombinasi lainnya.
Nilai positif kadar dekstran terdegradasi menunjukkan jumlah dekstran yang terdegradasi oleh dekstranase sehingga menambah kadar gula pereduksi nira setelah dibandingkan dengan sampel kontrol seperti yang terlihat pada perlakuan dosis 80 UD/l nira. Sementara nilai negatif kadar dekstran terdegradasi yang terus meningkat pada inkubasi akhir sampel 100 dan 120 UD/l nira setelah sebelumnya mencapai nilai positif tertingginya menunjukkan terjadinya penurunan kadar gula pereduksi secara umum yang terkonversi menjadi asam karena pengaruh mikroorganisme lain, terutama bakteri asam laktat yang masih bertahan hidup di dalam nira secara alami. Sementara, nilai negatif yang terjadi pada awal waktu inkubasi pada dosis tertinggi (120 UD/l nira) yang berlanjut menjadi nilai positif hingga mencapai nilai tertingginya menunjukkan masih terjadinya proses pembentukan dekstran oleh L. mesenteroides yang diketahui mampu bertahan hidup dalam nira yang konsentrasi gula tinggi.
Diketahui L. mesenteroides terkadang mampu bertahan menghasilkan dekstransukrase pasca tebu digiling atau saat proses degradasi menggunakan dekstranase berlangsung. Namun, bakteri ini terhambat dengan perlakuan agitasi selama degradasi dekstran berlangsung dan sel cenderung mengalami autolisis sehingga proses degradasi dekstran meningkat. Hal ini terbukti dari perubahan nilai negatif kadar dekstran terdegradasi di awal waktu inkubasi menjadi bernilai positif setelahnya sebagai kondisi adanya dekstran yang terdegradasi. Hamdy et al. (1954) melaporkan bahwa penurunan viskositas sebagai indikasi terdegradasinya dekstran ternyata masih terjadi, meski pada media yang didegradasi tersebut ditambahkan kultur L. mesenteroides-512.
Kondisi telah optimumnya perlakuan dosis enzim 80 UD/l nira diduga disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain :
1. Kesesuaian rasio enzim-substrat (dekstran) di dalam nira berhubungan dengan pembentukan ikatan kompleks enzim-substrat yang mempercepat degradasi dekstran dalam nira.
2. Kemungkinan adanya senyawa aktivator, khususnya ion logam di dalam nira. Menurut Miswar (1998), ion logam dalam bentuk garam yang mampu meningkatkan aktivitas dekstranase meliputi, ZnSO4, COCl2, FeCl3, MgCl2, MgSO4, Na2CO3, CaCl2, CuSO4, NaCl. Hal ini sesuai dengan laporan Honig (1953) bahwa komposisi non-gula nira mengandung garam organik K, Ca, Mg, Fe, Na, fosfat, klorida, nitrat sebesar 7 % dari keseluruhan bahan non gula.
3. Adanya campuran reaksi sukrosa, glukosa dan fruktosa di dalam nira mampu meningkatkan aktivitas degradasi dari dekstranase yang sangat menguntungkan untuk aplikasi dekstranase pada nira di pabrik gula (Murdiyatmo et al., 1997).
Berdasarkan karakteristik kadar dekstran dalam nira tebu MTG 48 jam yang diketahui sekitar 240 ppm dan aktivitas enzim (dekstranase) sebesar 248,66 UD/ml enzim dilakukan perhitungan rasio enzim/ppm dekstran dalam nira mentah yang tersaji pada Lampiran 12. Perlakuan dosis 80 UD/l nira yang optimum setara dengan rasio enzim/dekstran dalam sampel nira mentah MTG 48 jam STTH yang optimal sebesar 0,0014 ml enzim/ppm dekstran. Nilai ini menunjukkan bahwa kadar dekstran dalam nira mentah sebesar 1 ppm terdegradasi secara optimal dengan penambahan 0,0014 ml enzim (dekstranase Plus L). Perbandingan rasio ini diharapkan fleksibel dan aplikatif untuk dapat digunakan pada proses degradasi dekstran menggunakan dekstranase dalam kondisi dan karakteristik nira mentah yang berbeda di pabrik gula.
Sementara, pada dosis enzim yang jauh lebih tinggi (dosis 100 dan 120 UD/l nira) terjadi ketidaksesuaian rasio enzim-substrat (dekstran), dimana dekstranase yang ditambahkan terlalu banyak dan tidak sesuai dengan kadar dekstran dalam nira. Berlebihnya dekstranase yang
ditambahkan ke dalam nira mentah memungkinkan enzim untuk berikatan dengan senyawa inhibitor yang mampu menghambat aktivitasnya. Dilaporkan oleh Deerland-Enzymes (2005) bahwa dekstranase merk dagang dextranfree yang juga berasal dari C. erraticum terhambat oleh inhibitor ion logam Cu2+ dan Fe3+, sedangkan Khalikova et al. (2005) melaporkan dekstranase C. gracile terhambat oleh inhibitor Hg2+, Cu2+, dan Fe3+. Mekanisme pengikatan enzim (E) dan substrat (S) serta pengaruh inhibitor (I) disajikan pada Lampiran 13.
Dari perbandingan sampel yang ditambahkan enzim terlihat laju reaksi perlakuan dosis 120 dan 100 UD/l nira membutuhkan waktu lebih lama untuk degradasi dekstran yang maksimum. Masih tercapainya degradasi dekstran yang maksimum pada kedua dosis meski membutuhkan waktu lebih lama berindikasi terhadap terjadinya penghambatan kompetitif. Menurut Suhartono (1989) pada penghambatan kompetitif, enzimnya masih mampu mencapai kecepatan maksimum normalnya, walaupun dalam waktu yang lebih lama bila pada lingkungan tersebut terdapat senyawa inhibitor.
Untuk mengatasi penghambatan kompetitif dapat dilakukan dengan penambahan nira yang secara tidak langsung menambah dekstran yang dapat diikat oleh dektranase dalam nira. Menurut Suhartono (1989), penghambatan kompetitif dapat diatasi dengan menambahkan konsentrasi substrat yang memperbesar peluang bagi substrat untuk berikatan dengan sisi aktif enzim. Menurut Boyer et al. (1959), jumlah induser yang berperan meningkatkan keaktifan enzim hanya sampai batas tertentu dan akhirnya menurunkan keaktifan enzim. Dalam hal ini, penambahan nira perlu diperhitungkan rasio kadar dekstran di dalam nira dengan dosis enzimnya.
Proses degradasi dekstran oleh dekstranase merupakan proses hidrolisis yang membutuhkan air. Menurut Wilbraham dan Matta (1992), hidrolisis berarti pembelahan suatu molekul dalam air. Jika molekul terbelah, H+ dari air melekat pada salah satu produk, sedangkan OH -berikatan pada produk lainnya. Menurut Suhartono (1989), air merupakan salah satu pelarut yang mempunyai konstanta dielektrik tinggi (pelarut polar) sehingga dapat mengatasi kecenderungan bersatunya ion-ion yang
berbeda muatan karena gaya tarik menarik listrik antara ion-ion tersebut. Pada proses hidrolisis dekstran terjadi pengurangan air dalam nira yang berakibat melemahnya kemampuan konstanta dielektrik dalam memisahkan ion yang berbeda muatan, sehingga ion-ion logam dalam nira menjadi lebih mudah berikatan dengan enzim. Selain itu, semakin lama degradasi dekstran, aktivitas dekstranase akan semakin rendah. Hal ini, disebabkan oleh penurunan kerja sisi aktif enzim yang telah banyak berikatannya dengan substrat (dekstran), inhibitor, dan aktivator di dalam nira.
Hasil analisa korelasi parsial dengan kontrol perlakuan dosis enzim dan lama inkubasi (Lampiran 11) menunjukkan hubungan peningkatan kadar dekstran degradasi terhadap peningkatan kadar gula pereduksi (99 %), bahkan timbul korelasi terhadap penurunan viskositas (95 %). Hal ini membuktikan bahwa degradasi dekstran dalam nira mampu menambah gula pereduksi yang sebelumnya telah ada dalam nira, sedangkan korelasinya dengan penurunan viskositas disebabkan oleh degradasi dekstran.
Bertambahnya kadar gula pereduksi dapat memicu mikroorganisme lain untuk memanfaatkannya sebagai sumber karbon dan energi dengan mengubahnya menjadi asam yang terlihat sebagai nilai negatif diakhir waktu inkubasi selama degradasi dekstran. Tidak adanya korelasi kadar dekstran terdegradasi dengan pH disebabkan oleh kadar dekstran dalam nira yang didegradasi menjadi gula pereduksi terlalu kecil, namun hubungan ini diperkuat dengan nilai kadar dekstran terdegradasi dan pH yang sama-sama berkorelasi dengan viskositas sebagai salah satu parameter penting terdegradasinya dekstran yang memungkinkan berlanjut pada proses inversi gula pereduksi menjadi asam oleh mikroorganisme sebagai sumber karbon dan energinya. Selain itu, penurunan kerja sisi aktif enzim di akhir waktu inkubasi akibat berkurangnya air selam proses hidrolisis turut mendukung terbentuknya asam oleh aktivitas mikroorganisme tersebut di dalam nira.