BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.3 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis ialah metode pemisahan fisikokimia.Lapisan yang memisahkan, yang terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah, berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita (awal). Setelah pelat atau lapisan ditaruh di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan).Selanjutnya, senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan (dideteksi) (Stahl, 1985).
Kromatografi lapis tipis (KLT) bersama-sama dengan kromatografi kertas (KKr) dengan berbagai macam variasinya pada umumnya dirujuk sebagai kromatografi planar.Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1938. Pada kromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang
didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik. Meskipun demikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom (Rohman, 2009).
Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Gandjar dan Rohman, 2007).
Untuk campuran yang tidak diketahui, lapisan pemisah (sifat penjerap) dan sistem larutan pengembang harus dipilih dengan tepat karena keduanya bekerja sama untuk mencapai pemisahan. Selain itu, hal yang juga penting adalah memilih kondisi kerja yang optimum yang meliputi sifat pengembangan, atmosfer bejana, dan lain-lain (Stahl, 1985).
Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaanya lebih mudah dan lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom.Demikian juga peralatan yang digunakan.Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat (Gandjar dan Rohman, 2007).
2.3.1 Fase Diam (Lapisan Penjerap)
Lapisan dibuat dari salah satu penjerap yang khusus digunakan untuk KLT yang dihasilkan oleh berbagai perusahaan. Bila data KLT dikemukakan, bukan hanya spesifikasi umum penjerap yang harus disebutkan, tetapi juga jenis dan perusahaan pembuatnya. Bila dilihat dalam sinar jatuh dan sinar lewat, lapisan yang kering mempunyai wajah yang seragam dan membentuk ikatan yang baik
dengan penyangga. Panjang lapisan tersebut 200 mm dengan lebar 200 atau 100 mm. Untuk analisis, tebalnya 0,1 - 0,3 mm, biasanya 0,2 mm. Sebelum digunakan, lapisan disimpan dalam lingkungan yang tidak lembab dan bebas dari uap laboratorium (Stahl, 1985).
Penjerap untuk KLT ialah (diurut mulai dari yang paling penting) silika gel, alumina, kiselgur, dan selulosa. Semuanya lebih halus (melewati ayakan 200 mesh) daripada penjerap yang dipakai pada kromatografi kolom klasik dan kehalusannya sama seperti kehalusan penjerap untuk KCKT. Pada kenyataannya memang penjerap KLT dapat dipakai langsung pada beberapa sistem KCKT. Penjerap biasanya mengandung pengikat dan banyak juga yang sekaligus mengandung zat tambahan lain (Gritter, 1991).
Terdapat perbedaan yang sangat berarti anatar penjerap (dan lapisan siap pakai) yang berasal dari sumber niaga yang berlainan. Terutama silika gel mempunyai bermacam-macam sifat, bahkan kadang-kadang batch yang satu berbeda dengan batch yang lain meskipun pabriknya sama. Dianjurkan agar sedapat mungkin bekerja dengan memakai pelat yang berasal dari satu pabrik. Walaupun ada petunjuk pembuatan berbagai penjerap dalam pustaka, dianjurkan untuk membeli dari sumber niaga (Gritter, 1991).
2.3.2 Fase Gerak (Pelarut Pengembang)
Fase gerak ialah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Ia bergerak di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori, karena ada gaya kapiler. Yang digunakan hanyalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan, sistem pelarut multikomponen ini harus berupa suatu campuran
sesederhana mungkin yang terdiri atas maksimum tiga komponen. Angka banding campuran dinyatakan dalam bagian volume sedemikian rupa sehingga volume total 100, misalnya benzena-kloroform-asam asetat 96% (50:40:10). Pada kromatografi penjerap, pelarut pengembang dapat dikelompokkan ke dalam deret eluotropik berdasarkan efek elusinya. Efek elusi naik dengan kenaikan kepolaran pelarut. Misalnya heksana nonpolar mempunyai efek elusi lemah, kloroform cukup kuat, dan metanol yang polar efek elusinya kuat (Stahl, 1985).
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam mamilih dan mengoptimasi fase gerak:
• Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif
• Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2 – 0,8 untuk memaksimalkan pemisahan
• Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut nopolar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan. Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya, seperti
campuran air dan campuran metanol dengan perbandingan tertentu (Gandjar dan Rohman, 2009).
2.3.3 Aplikasi (Penotolan) Sampel
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak makan akan menurunkan resolusi (Rohman, 2009).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa penotolan sampel secara otomatis lebih dipilih daripada penotolan secara manual terutama jika sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15 µl (Gandjar dan Rohman, 2007).
Campuran yang akan dikromatografi harus dilarutkan di dalam pelarut yang agak nonpolar untuk ditotolkan pada lapisan. Pada umumnya, dipakai larutan 0,1-1%. Hampir segala macam pelarut dapat dipakai, tetapi yang terbaik yang bertitik didih antara 50o dan 100oC.Pelarut yang demikian mudah ditangani dan mudah menguap dari lapisan.Air hanya dipakai jika tidak ada pilihan (Gritter, 1991).
Bercak atau pita ditotolkan pada jarak 15 mm dari tepi bawah lapisan. Jarak suatu bercak awal, yang berukuran 3 – 5 mm, ke bercak awal lainnya dan jarak antara bercak paling pinggir dengan tepi samping sekurang-kurangnya 10 mm. Lapisan tidak boleh rusak selama penotolan cuplikan itu. Biasanya ditotolkan 1 – 10 µl larutan cuplikan 0,1 – 1%. Untuk menotolkan disarankan agar menggunakan mikropipet berujung runcing, khusus berskala 1 µl dan bervolume 10 µl (1 ml = 1000 µl).Larutan yang keatsiriannya rendah atau jumlahnya besar,
ditotolkan sebagian-sebagian; dalam hal ini pelarut dibiarkan menguap dahulu sebelum penotolan berikutnya dilakukan (Stahl, 1985).
2.3.4 Pengembangan
Pengembangan ialah proses pemisahan campuran cuplikan akibat pelarut pengembang merambat naik dalam lapisan. Jarak pengembangan normal, yaitu jarak antara garis awal dan garis depan, ialah 100 mm. Di samping pengembangan sederhana, yaitu perambatan satu kali sepanjang 10 cm ke atas, pengembangan ganda dapat juga digunakan untuk memperbaiki efek pemisahan yaitu dua kali merambat 10 cm ke atas berturut-turut pada pengembangan dua kali. Lapisan KLT harus dalam keadaan kering diantara kedua pengembangan tersebut, ini dilakukan dengan membiarkan pelat di udara selam 5-10 menit (Stahl, 1985).
Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel tersebut dalam suatu bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng lapis tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan ke dalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus di bawah lempeng yang telah berisi totolan sampel (Gandjar dan Rohman, 2007).
Bejana kromatografi harus tertutup rapat dan sedapat mungkin volume fase gerak sedapat mungkin (akan tetapi harus mampu mengelusi lempeng sampai ketinggian lempeng yang telah ditentukan). Untuk melakukan penjenuhan fase gerak, biasanya bejana dilapisi dengan kertas saring. Jika fase gerak telah mencapai ujung atas kertas saring, maka dapat dikatakan bahwa fase gerak telah jenuh (Gandjar dan Rohman, 2007).
Ada beberapa teknik untuk melakukan pengembangan dalam kromatografi lapis tipis, yaitu pengembangan menaik (ascending). Selain dengan cara menaik, dikenal pula pengembangan dengan cara menurun (descending), melingkar dan mendatar. Meskipun demikian, cara pengembangan menaik merupakan cara yang paling populer dibandingkan dengan cara menurun (Gandjar dan Rohman, 2007). 2.3.5 Deteksi
Setelah plat mengembang, bercak-bercak yang terbentuk segera dilihat (dengan menggunakan lampu ultraviolet jika memiliki gugus kromofor, atau dengan uap iodin jika tidak memiliki gugus kromofor) dan Rf masing-masing bercak ditentukan. Rf dalah hasil pembagian antara jarak perpindahan bercak dengan jarak pengembangan pelarut, dan dituliskan dalam bentuk nilai desimal (Cairns, 2008).
Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika, maupun biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan pencacahan radioaktif dan dengan fluoresensi dibawah sinar ultraviolet (Rohman, 2009).
2.3.5.1Lampu UV untuk Eksitasi Fluoresensi
Untuk daerah gelombang panjang kira-kira 365 nm, disarankan untuk menggunakan lampu uap raksa dengan bola kaca hitam dan prapenguat. Lampu
ini menghasilkan kekuatan radiasi yang jauh lebih besar ketimbang lampu pijar berkaca hitam (Stahl, 1985).
Lampu raksa bertekanan rendah dari kaca khusus dengan pelat filter kaca hitam, misalnya UG 5 Schott&Gen biasanya digunakan untuk eksitasi fluoresensi di daerah UV gelombang pendek. Lampu pembunuh hama yang kecil, dengan menggunakan filter yang disebutkan tadi, sangat bermanfaat. Suatu sudut kecil yang gelap atau suatu ruang kecil yang ditutup dengan tirai hitam merupakan tempat yang baik untuk melakukan pemeriksaan (Stahl, 1985).
2.3.5.2Deteksi dengan Pereaksi Semprot
Penting diingat bahwa pereaksi warna harus mencapai pelat KLT dalam bentuk tetesan yang sangat halus sebagai aerosol, dan bukan sebagai semprotan kasar. Biasanya hal ini tidak dapat dicapai bila digunakan penyemprot pompa bola. Penyemprot serba kaca digunakan dengan udara tekan (saluran udara tekan, kompresor kecil atau botol N2 dengan katup pengecil) (Stahl, 1985).
Jenis penyemprot tiga bagian yang mudah digunakan lebih menguntungkan dan lebih murah, karena itu disarankan untuk digunakan. Kaleng propelan dan wadah peraksi kacanya mudah diganti-ganti. Sebuah tabung reaksi dapat digunakan sebagai pengganti wadah pereaksi kaca, tabung ini berisi 10 ml pereaksi yang dapat digunakan untuk menyemprot langsung dengan cara mencelupkan pipa dan menekan tombol. Semprotan pertama harus diarahkan ke samping pelat KLT untuk mengecek semburan jet aerosol yang halus. Setelah itu barulah semprotan diarahkan ke pelat sambil menggerakkannya hati-hati ke seluruh lapisan (Stahl, 1985).