2.4. Teknik Pemisahan 1 Ekstraks
2.4.2.1. Kromatografi Lapis Tipis
Pemisahan senyawa dengan kromatografi lapis tipis dalam medium secara prinsip sama dengan kromatografi kertas, tetapi mempunyai beberapa keuntungan tambahan, misalnya lebih banyak campuran medium dan senyawa yang dapat digunakan. Senyawa fluoresen dapat digabungkan dalam medium untuk memudahkan identifikasi noda. Metode ini sangat cepat dan dapat dilakukan kurang dari 1 hari. Noda yang
dihasilkan sangat rapat, sehingga memungkinkan untuk mendeteksi senyawa dalam konsentrasi rendah. Senyawa yang dipisahkan dapat didekteksi dengan semprotan korosif pada suhu tinggi, dimana hal ini tidak dapat dilakukan pada kromatografi kertas.
Hal yang harus diperhatikan adalah atmosfer ruang pemisahan harus jenuh dengan pelarut, karena menentukan besar kecilnya nilai Rf. Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan wadah yang sekecil mungkin, dan menghubungkan dinding dengan kertas yang terendam dalam pelarut. Pengembangan pelarut dalam lempeng biasanya menggunakan teknik ascending, yang berlangsung lebih lambat dibandingkan dengan teknik descending. Letak senyawa hasil pemisahan dapat diketahui dengan menyemprot lempeng tipis dengan pereaksi atau dengan scanning bila menggunakan senyawa radioaktif (Bintang, 2010).
Kromatografi lapis tipis menggunakan lempeng kaca atau aluminium yang telah dilapisi dengan penyerap (misalnya silica gel) dengan ketebalan tertentu tergantung pada jumlah bahan yang akan dimuat ke dalam lempeng. Pelapisan ke dalam lempeng analisis biasanya memiliki ketebalan 0,2 mm; lempeng preparatif memiliki ketebalan hingga 1-2 cm. Campuran senyawa diisikan 1-2 cm dari tepi dasar lempeng berupa bercak ataupun pita memanjang. Lempeng kemudian dimasukkan ke dalam bejana kromatografi berisi pelarut yang telah ditentukan sebelumnya yang akan meresap naik di dalam lempeng dan memisahkan campuran senyawa berdasarkan polaritas komponennya. Lempeng lapis-penyerap sering menggunakan indikator fluoresensi (F254) sehingga bahan alam yang mengabsorpsi sinar UV gelombang
pendek (254 nm) akan tampak sebagai bercak hitam pada latar hijau. Pada sinar UV gelombang-panjang, senyawa tertentu dapat menampakkan fluoresensi biru atau kuning terang. Baik sifat absorbans UV maupun fluoresensi dapat digunakan untuk memantau pemisahan senyawa pada lempeng KLT. Metode ini memiliki sejumlah keuntungan untuk anailsis dan isolasi bahan alam yang aktif secara biologis :
a. Biayanya murah dibandingkan metode instrumental dan hanya butuh sedikit pelatihan atau pengetahuan tentang kromatografi.
b. Proses peningkatan skala dari cara analitik ke preparative mudah dilakukan dengan isolasi cepat bahan alam dalam jumlah miligram hingga gram.
c. Fleksibilitas dalam pemilihan fase gerak dan fase diam
d. Pemisahan mudah dioptimalkan dengan menargetkan satu komponen dan metode dapat segera dikembangkan.
e. Secara praktis semua pemisahan dapat dicapai dengan fase gerak dan fase diam yang tepat.
f. Sejumlah besar sampel dapat dianalisis atau dipisahkan secara simultan (Heinrich dkk, 2009).
Banyak sistem pelarut yang berbeda telah digunakan untuk pemisahan flavonoid dengan menggunakan KLT, antara lain :
Tabel 2.2 Sistem Pelarut pada Kromatografi lapis tipis untuk senyawa flavonoid
Sampel Eluen
Aglikon Flavonoid EtOAc-i-PrOH-H2O, 100:17:13
EtOAc-CHCl3, 60:40 CHCl3-MeOH, 96:4 Toluene-CHCl3-MeCOMe, 8:5:7 Toluene–HCOOEt–HCOOH, 5:4:1 Toluene–EtOAc–HCOOH, 10:4:1 Toluene–EtOAc–HCOOH, 58:33:9 Toluene–EtCOMe–HCOOH, 18:5:1 Toluene–dioxane–HOAc, 90:25:4 Flavonoid Glikosida n-BuOH–HOAc–H2O, 65:15:25
n-BuOH–HOAc–H2O, 3:1:1 EtOAc–MeOH–H2O, 50:3:10 EtOAc–MeOH–HCOOH–H2O, 50:2:3:6 EtOAc–EtOH–HCOOH–H2O, 100:11:11:26 EtOAc–HCOOH–H2O, 9:1:1 EtOAc–HCOOH–H2O, 6:1:1 EtOAc–HCOOH–H2O, 50:4:10
EtOAc–HCOOH–HOAc–H2O, 100:11:11:26 EtOAc–HCOOH–HOAc–H2O, 25:2:2:4 THF–toluene–HCOOH–H2O, 16:8:2:1 CHCl3–MeCOMe–HCOOH, 50:33:17 CHCl3–EtOAc–MeCOMe, 5:1:4 CHCl3–MeOH–H2O, 65:45:12 CHCl3–MeOH–H2O, 40:10:1 MeCOMe–butanone–HCOOH, 10:7:1 MeOH–butanone–H2O, 8:1:1
Flavonoid glukuronida EtOAc–Et2O–dioxane–HCOOH–H2O,
30:50:15:3:2
EtOAc–EtCOMe–HCOOH–H2O,
60:35:3:2
Aglikon Flavanone CH2Cl2–HOAc–H2O, 2:1:1
Flavanone glikosida CHCl3–HOAc, 100:4
CHCl3–MeOH–HOAc, 90:5:5 n-BuOH–HOAc–H2O, 4:1:5 (upper layer) Khalkon EtOAc–hexane, 1:1 Isoflavon CHCl3–MeOH, 92:8 CHCl3–MeOH, 3:1
Isoflavon glikosida n-BuOH–HOAc–H2O, 4:1:5 (upper
layer)
Dihidroflavonol CHCl3–MeOH–HOAc, 7:1:1
Biflavonoid CHCl3–MeCOMe–HCOOH, 75:16.5:8.5
Toluene–HCOOEt–HCOOH, 5:4:1 Antosianidin dan Antosianin EtOAc–HCOOH–2 M HCl, 85:6:9
n-BuOH–HOAc–H2O, 4:1:2
EtCOMe–HCOOEt–HCOOH–H2O,
EtOAc–butanone–HCOOH–H2O, 6:3:1:1 Proantosianidin EtOAc–MeOH–H2O, 79:11:10 EtOAc–HCOOH–HOAc–H2O, 30:1.2:0.8:8 (Andersen, 2006) 2.4.2.2. Kromatografi Kolom
Kromatografi cair yang dilakukan di dalam kolom besar merupakan metode kromatografi terbaik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar (lebih 1 g). Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca. Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari kolom. Untuk pemisahan normal, nisbah bobot 30 : 1 ternyata memadai jika pemisahan tidak terlalu sulit, yang biasanya ditunjukkan dengan bercak-bercak yang letaknya berjauhan pada KLT. Jika pemisahan lebih sulit, harus digunakan nisbah penjerap : linarut yang lebih tinggi yaitu 100 : 1 atau bahkan 300 : 1, dan lebih sering digunakan kolom kecil panjang.
Ukuran partikel penjerap untuk kolom biasanya lebih besar daripada untuk KLT. Kemasan kolom biasanya 63-250 µm untuk kolom yang dijalankan dengan gaya tarik bumi. Kolom yang dijalankan memakai tekanan udara atau pompa, biasanya mengandung partikel 40-63 µm atau lebih halus. Penjerap KLT biasanya dapat melewati ayakan 250 mesh dan mempunyai ukuran partikel lebih kecil dari 63 µm (Gritter, 1991).
Pemisahan senyawa dengan kromatografi kolom merupakan salah satu teknik pemisahan yang banyak digunakan. Hal yang perlu diperhatikan adalah penyediaan kolom, operasi kolom, serta pemilihan pelarut yang tepat sebelum melakukan
kromatografi. Kolom kromatogafi biasanya terbuat dari gelas. Panjang kolom biasanya disesuaikan dengan jumlah komponen yang akan dianalisis dalam suatu senyawa, sedangkan lebar kolom disesuaikan dengan jumlah senyawa yang akan dianalisis. Bahan yang dapat dipakai untuk sediaan kromatografi sebagai pengisi kolom cukup banyak jenisnya. Selama proses kesetimbangan dengan pelarut, bahan pengisi kolom dibiarkan mengendap, dan partikel-partikel halus yang tertinggal dalam suspensi dibuang dengan cara dekantasi. Jika hal ini tidak dilakukan, maka laju alir pelarut yang menuruni kolom akan menurun karena tersumbat oleh partikel-partikel halus.
Kolom kromatografi harus benar-benar padat, bahan kolom kira-kira sepertiga pelarutnya. Suspensi akan tetap tinggal pada kolom, sedangkan kelebihan pelarut akan turun meninggalkan kolom. Lebih baik pada proses turunnya pelarut pada kolom dibantu dengan membuka kran agar larutan menetes, sehingga isi kolom lebih cepat turun. Saat meneteskan sampel dengan pada permukaan kolom, sebaiknya kran kolom dibuka, agar eluen menetes dan sampel masuk ke dalam kolom.
Metode pemisahan kromatografi didasarkan pada perbedaan distribusi molekul-molekul komponen di antara fase gerak dan fase diam berdasarkan perbedaan tingkat kepolaran. Komponen akan bergerak lebih cepat meninggalkan kolom bila molekul-molekul komponen tersebut berinteraksi secara lemah dengan fase diam. Daya interaksi komponen yang akan dipisahkan dengan fase diam sangat menentukan tingkat keberhasilan kromatografi (Bintang, 2010).
2.4.2.3. Harga Rf (Reterdation Factor)
Mengindentifikasi noda-noda dalam lapisan tipis lazim menggunakan harga Rf yang diidentifikasikan sebagai perbandingan antara jarak perambatan suatu zat dengan jarak perambatan pelarut yang dihitung dari titik penotolan pelarut zat. Jarak yang ditempuh oleh setiap bercak dari titik penotolan diukur dari pusat bercak. Untuk mengidentifikasi suatu senyawa, maka harga Rf senyawa tersebut dapat dibandingkan dengan harga Rf senyawa pembanding.
Jarak perambatan bercak dari titik penotolan Rf =
Jarak perambatan pelarut dari titik penotolan (Sastrohamidjojo, 1996)