Gliserol 50 %
TBE 5 x
Bromofenol biru 0,3 %
Dilarutkan 30 mg bromo fenol biru di dalam 4,25 ml larutan 10 x TBE (larutan stok), ditambahkan 5,75 ml larutan gliserol 87 %. Larutan ini disimpan pada suhu kamar.
Pembuatan Larutan DNA Marker
Larutan 100 l pasangan basa (bp) DNA ladder (100 l). Dilarutkan 25 l dari 100 bp DNA ladder (Gibco BRL life Technologies Inc Gaithersburg USA) di dalam 25 l larutan 5 x buffer loading dan 50 l air destilata steril.
Pembuatan Larutan 1 Kilo basa (Kb)
Dilarutkan 25 ul 1 Kb plus DNA ladder (Gibco BRL life Technologies Inc Gaithersburg USA) di dalam 25 ul 5 x buffer loading dan 50 ul air destilata steril.
Pembuatan Larutan Ethidium Bromida (Larutan stok)
Dilarutkan 1 gram ethidium bromida di dalam 100 ml air destilata steril (larutan stok). Larutan stok ini disimpan di dalam botol berwarna coklat pada suhu 40C. Dipipet 1 ml ke dalam tabung eppendorf untuk setiap kali pemakaian.
Pembuatan Larutan Enzim Restriksi Mlu 1
Komposisi buffer Mlu 1 terdiri dari :
Tris HCl dengan pH 7,4 50,0 mM
NaCl 50,0 mM
mM EDTA 0,1 mM
serum albumin 500 ug/ml
Gliserol 50 % (v/v)
Triton X 0,1 % (w/v)
Pereaksi untuk Sekuensing DNA
Komposisi Jumlah Konsentrasi akhir
Premix (Perkin Elmer USA) 4 ul 1 x
DNA utas rangkap x ul (250 ng) 250 ng/ul
Primer (ITS1 ITS4 10 pmol) 1 ul 1 pmol
H2O (steril) cukupkan menjadi 10 u
Diambil fruiting body Ganoderma yang dibawa dari lapangan, kemudian dibersihkan dengan menggunakan aquadest, kemudian dipotong persegi dengan ukuran 1 x 1 x 1 cm, lalu disterilkan dengan klorox 0,1 % selama 15 30 detik, kemudian dicuci dengan air steril sebanyak 2 kali lalu dikering anginkan di atas kertas saring yang bersih. kemudian potongan tersebut diambil dengan menggunakan pinset dan ditanam di atas media PDA (Potato Dextrose Agar)
yang terdapat di dalampetridishdengan metodathree pointdan dibiarkan sampai miselium jamur tumbuh selama 1 minggu pada media biakan tersebut. Miselium yang diperoleh pada tahapan ini sering terkontaminasi oleh jamur dan bakteri, untuk itu perlu dilakukan penanaman ulang pada media pertumbuhan PDA baru sampai diperoleh biakan murni. Setelah diperoleh biakan murni, maka sebagian dari isolat ini ditumbuhkan pada media cair Malt-Yeast ekstrak selama 30 hari pada suhu kamar yang selanjutnya digunakan untuk ekstrak DNA.
Identifikasi Jamur
Biakan murni yang telah didapat dari hasil biakan diamati di bawah mikroskop dengan mengambil sampel biakan dengan menggunakan selotip transparan dan dilekatkan di atas object glass yang telah ditetesi dengan methyl blue yang berfungsi untuk memberi warna agar lebih mudah dalam mengidentifikasi jamur yang diamati.
Penggerusan Miselium untuk Persiapan Ekstraksi DNA
Miselium hasil pertumbuhan pada media biakan cair malt-Yeast ekstrak disaring dengan kertas saring Whatman nomor 1 steril lalu dicuci dengan air steril sebanyak 2 kali. Miselium yang diperoleh dipindahkan ke dalam cawan petri yang bersih lalu dikeringkan pada suhu 700C selama satu malam. Miselium kemudian dipindahkan ke dalam lumpang porselen kemudian digerus sampai halus dengan penambahan gas N2 cair serta penambahan serbuk polyvinyl pirolidin (PVPP) secukupnya. Serbuk halus yang diperoleh digunakan untuk esktraksi DNA. Sebelum digunakan disimpan di dalam freezer pada suhu -200C.
Ekstraksi DNA Menggunakan Metode Moller 1992
Disuspensikan 50 mg serbuk miselium ke dalam 500 l buffer pengekstaksi Moller, ditambahkan 5 l larutan proteinase K, lalu diinkubasi pada suhu 650C di dalam waterbat selama 1 jam. Ditambahkan 140 l larutan NaCl untuk mencukupkan konsentrasi garam dan 65 l larutan CTAB 65 % lalu diinkubasi pada suhu 65 0C di dalam waterbat selama 10 menit. Ditambahkan 1 voluma kloroform : isoamil alkohol (KIAA), lalu diinkubasi pada suhu 0 0C di dalam freezer 10 menit. Campuran ini kemudian disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit pada suhu kamar. Dari hasil sentrifugasi ini diperoleh 3 lapisan atas didekantasi ke dalam tabung ependorf yang baru dan steril sedangkan sisanya dibuang. Ditambahkan 225 l larutan amonium asetat 5 M, lalu di vortek. Kemudian didinginkan pada batu es di dalam kulkas selama 30 menit. Hasil pendinginan ini kemudian di sentrifugasi pada 13000 rpm selama 5 menit pada suhu kamar. Cairan pada bagian atas didekantasi ke dalam tabung ependorf yang
baru dan steril. Kemudian ditambahkan 25 l larutan enzim Ribonuklease lalu diinkubasi pada suhu 370 C selama 10 menit di dalam waterbat. Kemudian ditambahkan larutan isopropanol dingin lalu disimpan pada suhu -200C selama 30 menit. Larutan hasil pendinginan disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit pada suhu kamar. Dekantasi larutan bagian atas dengan hati hati serta endapan yang diperoleh dicuci dengan alkohol 70 %, lalu dikeringkan pada suhu 500 C selama 5 menit. Endapan yang diperoleh dilarutkan dengan 50 l larutan buffer TE kemudian disimpan pada suhu -200C sebelum dilanjutkan untuk uji kualitas DNA hasil ekstraksi.
Uji kualitas DNA Hasil Ekstraksi dengan Metode Elektroforesis Gel Agarosa
Ditimbang 1,5 gram serbuk agarosa lalu masukkan ke dalam beaker gelas kecil. Ditambahkan 100 ml buffer TBE, lalu dipanaskan pada microwave sampai dengan mendidih. Didinginkan pada suhu 600 C, lalu dituangkan ke dalam alat pencetak gel yang pada salah satu ujungnya telah disisipkan dengan sisir alat pencetak sumur. Dibiarkan sampai memadat sehingga terbentuk gel. Gel diangkat lalu dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis yang telah diisi dengan buffer TBE. Dipepet 1 l dari masing masing DNA hasil isolasi dari tiap sampel lalu dicampur dengan larutan buffer loading pada strip parafilm bersih yang telah tersedia pada meja elektroforesis, kemudian ditotolkan ke dalam tiap tiap lubang sumur pelat elektroforesis. Dengan jumlah yang sama juga dilakukan untuk DNA marker pada salah satu lubang sumur. Elektroforesis dilakukan pada arus listrik 75 volt selama 70 menit. Gel kemudian diangkat lalu direndam di dalam larutan Etidium Bromida selama 30 menit, kemudian dicuci dengan aqua steril selama 15
menit. Gel kemudian diletakkan di bawah sinar UV lalu difoto dengan film polaroid. Dari hasil uji yang dilakukakan dengan metode elektroforesis semua DNA hasil ekstraksi dari tiap sampel memberikan hasil positif dengan pita tunggal sebanyak 650 pasang basa (bp).
Amplifikasi DNA Utas Rangkap Hasil Ekstraksi sebagai Target dengan Menggunakan Primer ITS 1 ITS 4 dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)
Pengembangan diagnosa molekuler untuk identifikasi dan diferensiasi
Ganoderma penyebab penyakit busuk pangkal batang pada daerah ITS 1 ITS 4
pada penelitian ini dilakukan dengan metode PCR.
Primer diurutkan dengan program komputer Oligo 40 2109 dan analisis primer dilakukan dengan metode rychlik (1989 1991) dan metode Roads (1989) yang disesuaikan dengan urutan basa basa ITS 1 ITS 4 dari rDNA
Ganoderma. Urutan basa basa primer ini dibuat oleh European Molecular Biology Labolatory (EMB) dengan nomor akses X. 78749. Urutan srtuktur primer adalah :
ITS 1 5 - TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 sebagai forward primer ITS 4 5 - TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 sebagai reverse primer
Prosedur kerja PCR menggunakan metode Niefold dan Schober Butin (1997) dalam utomo (2000). Komposisi buffer, campuran nukleotida primer, campuran dNTPs, konsentrasi Tag DNA polymerase dapat dilihat sebagai berikut :
Komposisi Pereaksi untuk Amplifikasi PCR
Komposisi Jumlah Konsentrasi akhir
10 x buffer PCR 2,5 ul 1 x
MgCl 1,0 ul
dNTPs (campuran) 2,5 ul
Primer (campuran ITS1,ITS4) 1,0 ul DNA target (hasil isolasi) 2,0 ul
Tag DNA polymerase 0,4 ul
H2O steril 13,4 ul
Total 22,8 ul (tambahkan sedikit minyak mineral)
Thermocycler (MJ Reseach Programable Thermo Cycler Type PTC 100 MJ Reseach Inc Massachusetts USA diprogram sebagai berikut :
Denaturasi pada suhu 950C selama 5 menit dan denaturasi selanjutnya pada 950C selama 30 menit. Penapisan (annealing) primer dilakukan pada suhu 520C, sedangkan pemanjangan rantai DNA (extention) dilakukan pada suhu 720C selama 50 detik. Diatur siklus sebanyak 35 kali. Penyempurnaan reaksi pada suhu 720C dengan menginkubasi selama 10 menit pada suhu 40C. Sebelum dilakukan pengujian kualitas DNA hasil amplifikasi sampel disimpan pada suhu -200C.
Uji Kualitas DNA Produk PCR Pada Daerah ITS 1 ITS 4 Dengan Metode Elektroforesis
Dimasukkan gel elektrofesis ke dalam chamber elektroforesis yang telah berisi larutan buffer TBE, dipipet 3 ul loading buffer lalu diteteskan pada strip parafilm bersih yang terdapat di meja elektroforesis. Ditambahkan masing
masing 10 ul produk PCR pada setiap totolan lalu dihomogenkan. Dilakukan juga dengan cara yang sama untuk DNA marker (hanya satu kali saja). Ditotolkan tiap hasil totolan di atas secara teratur pada tiap tiap sumur yang telah tersedia pada pelat elektroforesa. Dieletroforesis dengan kekuatan 75 volt selama 70 menit, kemudian pelat diangkat dan direndam dalam larutan Ethidium Bromida selama 30 menit kemudian direndam dalam akua steril selama 10 menit sebagai pencuci. Hasil divisualisasi dengan sinar UV dan difoto dengan foto polaroid
Peubah amatan
1. Pengamatan gejala serangan dan persentase serangan penyakit di lapangan dilakukan secara visual. Persentase serangan dihitung dengan menggunakan rumus : PS = x100% b aa Keterangan : PS : Persentase serangan a : jumlah tanaman yang sakit b : jumlah tanaman yang sehat (Baharuddin dkk, 2004)
2. Untuk mengetahui laju infeksi penyakit di lapangan dihitung dengan menggunakan rumus :
r = 2,3 / t log 10 Xt / Xo Keterangan :
r = laju infeksi
Xo = jumlah tanaman terserang penyakit mula mula Xt = Jumlah tanaman penyakit setelah pengamatan 2,3 = Bilangan alami.
( Oka, 1993 ).
3. Menganalisa karakter DNA dari jamur Ganderma sp dengan menggunakan metodePolymerase Chain Reaction(PCR) .