BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA
H. Media Selektif E. coli dan AKK
Media pembenihan adalah media yang mengandung nutrisi yang disiapkan untuk menumbuhkan bakteri di dalam skala laboratorium. Media pembenihan harus dapat menyediakan energi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri. Media harus mengandung karbon, nitrogen, sulfur, fosfor dan faktor pertumbuhan organik. Media pembenihan harus mengandung nutrisi yang tepat untuk bakteri spesifik yang akan dibiakkan, kelembaban harus cukup, pH sesuai, kadar oksigen tercukupi, media pembenihan harus steril dan tidak mengandung mikroba lain, media diinkubasi pada suhu tertentu sesuai dengan karakteristik mikrobia uji (Radji, 2011).
Media yang digunakan untuk pengujian AKK adalah Potato Dextrose Agar (PDA). Media ini menyediakan nutrisi untuk menstimulasi pertumbuhan konidium pada jamur (Murray, 1999). Identifikasi bakteri misalnya menggunakan media selektif yaitu media yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu atau lebih mikroorganisme tertentu, tetapi akan menghambat/mematikan jenis lainnya. E.coli Broth (ECB) merupakan media yang memfasilitasi bakteri coliform yaitu E.coli, Enterobacter aerogenes, dan citrobacter fruendii untuk memfermentasikan
laktosa. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pembentukan gas (Cappucino, 2008).
Media differensial merupakan media untuk menumbuhkan mikroba tertentu serta menentukan sifat-sifatnya. Media Tryptone Bile X-Glucoronide (TBX) merupakan media yang mengandung agen kromogenik x-ß-D-glukoronide yang dapat mendeteksi keberadaan enzim glukoronidase yang terdapat pada E.coli. Bakteri E.coli akan menyerap agen kromogenik x-ß-D-glukoronide sehingga akan terjadi interaksi dengan enzim glukoronidase. Setelah terjadi proses fermentasi maka agen kromogenik akan disekresikan ke luar sel yang akan menimbulkan warna hijau-kebiruan sehingga memudahkan dalam proses identifikasi E.coli (Bridson, 2006).
I. Identifikasi E. coli
Uji identifikasi E. coli merupakan serangkaian uji berdasarkan karakteristik E. coli. Uji ini dilakukan dengan menggunakan media dan reagen khusus, seperti uji fermentasi gula-gula (glukosa laktosa, manitol, maltosa, sukrosa), uji Sulfur Indol Motility (SIM), dan uji IMVIC (Indol, Metil merah, Voges Proskauer, dan Sitrat) (Holt, 2000).
1. Uji fermentasi gula-gula
Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan gula-gula spesifik yang mencerminakan sifat bakteri tersebut dan dapat digunakan sebagai salah satu cara untuk mengidentifikasi bakteri (Nugraheni, 2010). Bakteri fakultatif seperti E. coli dapat memfermentasikan glukosa dalam keadaan aerob maupun anaerob. Fermentasi karbohidrat secara
anaerob menghasilkan asam organik seperti asam format, asam laktat, asam asetat, disertai gas hydrogen dan karbondioksida (Cappuccino, 2008).
Glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sukrosa merupakan karbohidrat yang sering digunakan untuk uji ini. Media yang digunakan mengandung glukosa dan ditambahkan indikator fenol merah. Terjadinya fermentasi karbohidrat dapat dilihat dengan perubahan warna media dari merah menjadi kuning yang menandakan adanya asam dan terbentuk gas yang terjebak dalam tabung Durham (Lay, 1994).
2. Uji Sulfur Indol Motility (SIM)
Uji Sulphur Indol Motility (SIM) adalah pengujian dengan 3 parameter pengamatan, yaitu uji pembentukan sulfur, uji pembentukan indol, dan pengamatan motilitas (pergerakan bakteri). Media yang digunakan dalam pengujian ini terdiri dari 3 media yang dijadikan dalam satu media yang berisi Pancreatic Digest of Casein, Peptic Digest of Animal Tissue, Ferrous Ammonium Sulphate, Sodium Thiosulphate, dan Nutrient Agar. Uji indol perlu ditambahkan reagen Kovacs, sedangkan kandungan Ferrous Ammonium Sulphate dan Sodium Thiosulphate digunakan untuk uji H2S dan Nutrient Agar digunakan untuk uji motilitas (Finegold dan baron, 1996).
Uji sulfur digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri menguraikan asam amino menjadi sulfur yang diproduksi oleh beberapa jenis mikrobia melalui pemecahan asam amino yang mengandung belerang seperti lisin dan metionin. Sulfur dapat diproduksi melalui reduksi senyawa-senyawa belerang anorganik, seperti: tiosulfat, sulfit atau sulfat. Keberadaan H2S dapat diamati degan
menambahkan garam-garam logam berat ke dalam medium. Uji SIM dikatakan positif apabila H2S bereaksi dengan senyawa-senyawa ini ditadai dengan terbentuknya logam sulfit berwarna hitam karena bakteri yang berada dalam medium tersebut tidak dapat menghidrolisis logam-logam berat yang terkandung dalam medium (Nugraheni, 2010).
Uji motilitas digunakan untuk melihat pergerakan bakteri. Uji motilitas menggunakan media NA semisolid yang memudahkan bakteri berflagel untuk melakukan pergerakan. Karakteristik E. coli adalah memiliki flagel diseluruh badan bakteri (petrich) sebagai alat untuk bergerak yang membedakan dengan bakteri lainnya. Hasil uji akan terlihat dengan pertumbuhan bakteri menyebar pada hasil tusukan yang menandakan bahwa bakteri yang diuji adalah golongan Enterobacter, dan E. coli termasuk dalam Enterobacter. Hasil positif untuk mengidentifikasi E. coli adalah dengan melihat pertumbuhan bakteri yang menyebar pada hasil tusukan (Holt, et al., 2000)
3. Uji IMVIC
a. Uji Indol. Bakteri E. coli menggunakan sumber triptofan sebagai sumber karbon. Bakteri E. coli tersebut memiliki enzim triptofanase yang mengkatalisasikan penguraian gugus indol dan triptofan. Keberadaan cincin warna merah muda di permukaan media karena
penambahan reagen Kovac’s menandakan pembentukan indol (Lay,
1994).
b. Uji Metil Merah. Uji metil merah digunakan untuk mengetahui apakah bakteri mampu memfermentasi asam campuran. Beberapa jenis
bakteri yang mampu memfermentasi glukosa akan menghasilkan produk yang bersifat asam yang menyebabkan terjadinya penurunan pH media pertumbuhan menjadi lebih rendah. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna menjadi merah (Lay, 1994).
c. Uji Voges Proskauer. Uji ini berguna untuk mengidentifikasi mikroba yang mampu memfermentasi 2,3-butanadiol. Jika mikroba telah mampu untuk memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol sebagai produk utama maka akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Penambahan reagen kalium hidroksida dan alfanaftol dapat menentukan adanya asetoin yang merupakan senyawa perkusor dalam sintesis 2,3-butanadiol. Setelah penambahan reagen kalium hidroksida, adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna menjadi merah pada medium yang akan diperjelas dengan penambahan alfanaftol (Lay, 1994).
d. Uji Sitrat. Uji sitrat bertujuan untuk mengetahui penggunaan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi terutama untuk bakteri gram negatif golongan Enterobacter. Uji sitrat menggunakan media
Simmon’s Citrate Agar yang merupakan medium sintetik dengan Na
sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. NH4 sebagai sumber N, dan menggunakan indikator pH Brom Thymol Blue. Warna media akan berubah dari warna hijau menjadi biru jika asam dihilangkan dan
terjadi peningkatan pH karena mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai sumber karbon dan energi (Lay, 1994).