Waktu dan Tempat penelitian
Penelitian ini dilakukan dari Februari sampai dengan Juli 2010 di Laboratorium Protozoologi, dan Laboratorium Helmintologi bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan, Departemen Ilmu Panyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah hewan coba berupa mencit putih, P. berghei, infusa C. papaya L., pakan mencit (pelet ikan), kertas
saring, heparin, NaCl fisiologis, gliserol, metanol, pewarna Giemsa, phosphate
buffer saline (PBS), xylol, minyak emersi, dan tissue.
Alat yang digunakan adalah mikrohematokrit (tabung kapiler), syringe 1 ml,
syringe 10 ml, gelas objek, microtube, cawan penguap, gelas ukur, mortar, sonde lambung, kandang mencit, timbangan listrik, mikroskop cahaya, dan lemari pendingin.
Cara Kerja
Persiapan percobaan Preparasi Hewan Coba
Penelitian ini menggunakan mencit strain Swiss Albino jantan dan betina
sebanyak 36 ekor yang memiliki berat 25 g berumur 1.5-2.5 bulan. Hewan tersebut diperoleh dari kandang mencit taman syifa Bogor. Mencit dipelihara dalam kandang yang cukup untuk 3-5 mencit.
Pada penelitian ini mencit yang digunakan ditempatkan di dalam kotak kandang yang terbuat dari polipropilen atau polikarbonat dan diberi alas kandang sekam padi secukupnya. Kandang tersebut diberi penutup kawat serta tempat makan dan botol minum. Dalam satu kandang dipelihara mencit sebanyak 3-5 ekor disesuaikan dengan ukuran kandanganya..
Pakan yang diberikan untuk mencit secara tanpa batasan (ad libitum). Air
(Smith & Mangkoewidjojo 1988). Tingkat konsumsi makanan dan air minum bervariasi menurut temperatur kandang, kelembaban, kualitas makanan, kesehatan dan kadar air dalam makanan (Malole & Pramono 1989). Pakan yang digunakan untuk hewan coba ini yaitu berupa pellet ikan yang sudah diatur komposisinya sehingga memenuhi nilai nutrisi.
Pengambilan Darah Pada Mencit
Darah diperoleh dari medial canthus sinus orbitalis dengan menggunakan
mikrohematokrit atau tabung kapiler dengan posisi yang tepat. Dengan cara ini dapat diperoleh sampel darah sampai 0.5 ml tiap dua atau tiga minggu, tetapi perlu hati-hati karena hewan dapat mati kehabisan darah (Smith &
Mangkoewidjojo 1988). Darah tersebut digunakan untuk stok P. berghei.
Penyimpanan dan Pembuatan Stok Plasmodium berghei
Stok P. berghei diperoleh dari Badan Penelitian dan Pengembangan
Kesehatan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia yang sudah diinfeksi selama lima hari pada mencit albino dan diambil dengan menggunakan pipa kapiler yang sudah berisi antikoagulan melalui intraorbital mata dan kemudian
disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu -70oC (Jekti et al 1996). Stok
P. berghei dimasukan ke dalam microtube yang diberi heparin kemudian ditambahkan gliserol dengan tujuan agar darah tidak lisis dan rusak.
Darah yang terdapat pada pipa kapiler dialirkan ke microtube yang sudah
diberikan heparin, kemudian ditambahkan gliserol kedalam microtube dengan
tujuan supaya darah tidak lisis dan rusak ketika disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu -70ºC sehingga dapat bertahan dalam jangka waktu yang lama.
Sediaan ini digunakan selama penelitian berlangsung. P. Berghei diinokulasi,
sediaan darah yang disimpan diambil dengan syringe 1 ml kemudian diencerkan dengan NaCl fisiologis, dengan perbandingan 1 bagian sediaan darah dengan 7 bagian NaCl fisiologis untuk 4 ekor mencit yang diinfeksikan, kemudian diinfeksikan melalui intraperitonial dengan menggunakan syringe 1 ml.
Pembuatan Infusa Daun Papaya (C. papaya L.)
Infusa papaya diperoleh dengan mengeringkan daun papaya kemudian
direbus dalam air dengan perbandingan (25:100) sampai mendidih (900C) selama
10-15 menit (Wintarsih et al 2009) setelah itu disaring. Kadar sambiloto dalam
infusa diukur dalam rotarioevaporator dan didapat kandungan papaya dalam cairan yaitu 0.98 g/ml.
Penelitian ini menggunakan beberapa kali pengenceran yaitu 1x10-2,
1x10-4, dan 1x10-6. Pengenceran didapat dengan cara 1 ml infusa ditambah dengan
99 ml akuades kemudian dilakukan pengocokkan manual dengan menggunakan tangan sebanyak 170 kali dalam satu menit. Adapun tujuan dari pengocokan dan pengenceran ini adalah untuk memecah partikel- partikel ekstrak menjadi berukuran nanometer (nm) sehingga akan mempercepat dan mengefektifkan perjalanan obat menuju targetnya.
Percobaan
Kelompok Perlakuan Penelitian
Pada penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pengulangan 3 kali dengan 5 kelompok perlakuan yaitu kontrol normal (tidak diinfeksi dan tidak diobati), kontrol negatif (diinfeksi tetapi tidak diobati), PA1
(infusa C. papaya L. dengan pengenceran 1x10-2), PA2 (infusa C. papaya L.
dengan pengenceran 1x10-4), dan PA3 (infusa C. papaya L. dengan pengenceran
1x10-6). Penelitian ini menggunakan mencit sebanyak 30 ekor, kontrol normal
sebanyak 6 ekor mencit, kontrol negatif 6 ekor, dan masing-masing kelompok
perlakuan menggunakan infusa C. papaya L. dengan berbagai pengenceran
sebanyak 6 ekor. Masing-masing kelompok perlakuan terdiri atas 3 ekor mencit jantan dan 3 ekor mencit betina.
Infeksi Plasmodium berghei
P. bergehi diinfeksikan pada mencit yang memiliki berat rata-rata 25 g
berumur 1.5-2.5 bulan secara intraperitoneal dengan dosis sebanyak 0.25x106 per
ekor. Dosis parasit ditentukan mula-mula dengan menghitung presentasi parasit dari ulasan darah yang diwarnai Giemsa kemudian dihitung jumlah parasit per
jumlah eritrosit. Tahap selanjutnya yaitu perhitungan jumlah eritrosit dengan cara darah diencerkan dengan menggunakan larutan Hayem dalam pipet kapiler
eritrosit kemudian dilakukan perhitungan eritrosit menggunakan Improved
Neubauer Counting Chamber. Jumlah eroitrosit didapat dengan membandingkan
jumlah eritrosit dengan volume counted (0.02) lalu dikalikan dengan pengenceran
(200) per µl. Jumlah dosis parasit diperoleh dengan mengkalikan presentasi parasit dengan jumlah eritrosit yang telah dihitung dan dikonversikan menjadi per ml.
Pemberian Infusa Daun Papaya Pada Mencit
Infusa daun (C. Papaya L.) diberikan pada mencit sebanyak 0.5 ml/hari
dengan cara peroral menggunakan sonde lambung dimulai dari pengenceran
terendah (1x10-2, 1x10-4 dan 1x10-6). Pemberian infusa daun papaya
(C. papaya L.) dilakukan selama 4 hari secara berturut- turut, dimulai pada hari pertama setelah infeksi sampai hari ke-4 setelah infeksi. Kandungan daun papaya dalam infusa adalah 0.93 g/ml. Untuk kandungan daun papaya setiap perlakuan
PA1, Pa2 dan PA3 adalah 4.65 mg/0.5 ml; 0.0465 mg /0.5 ml; 0.000465 mg/0.5 ml.
Preparasi Ulas Darah
Pembuatan ulas darah dilakukan dengan cara pengambilan darah dari ekor mencit kemudian diteteskan pada gelas objek pertama dengan posisi mendatar. Gelas objek lain ditempatkan pada bagian darah tadi dengan posisi membentuk
sudut 45o sehingga darah menyebar sepanjang garis kontak antar kedua gelas
obyek. Selanjutnya gelas objek didorong kearah depan dengan cepat hingga terbentuk usapan darah tipis di atas gelas objek. Ulas darah tersebut dikeringkan diudara kemudian difiksasi dengan mengunakan metanol selama 5 menit lalu
dimasukkan ke dalam pewarnaan Giemsa selama 30 menit (Sastradipradja et al
1989), selanjutnya dicuci dengan air mengalir pada posisi miring dan dikeringkan diudara.
Perhitungan Diferensiasi Leukosit
Perhitungan diferensiasi leukosit dilakukan di bawah mikroskop dengan menggunakan minyak emersi denagn pembesaran 1000x. Setiap 100 leukosit yang ditemukan dihitung dan dikelompokkan ke dalam masing-masing jenis leukosit, yaitu neutrofil, eosinofil, basofil, limfosit, dan monosit. Perhitungan leukosit menggunakan beberapa lapang pandang sepanjang ulasan yang digeser kearah tengah kemudian bergeser sejajar denagn tepi ulasan dan bergerak ke tepi kembali dan seterusnya sampai mencapai jumlah leukosit sebanyak 100. Nilai relatif leukosit yang ditemukkan dinyatakan dalam satuan persen.
Pengolaahan Data
Data hasil pengamatan diolah dengan menggunakan uji ANOVA (Analysis
of Varian) –SPS System 17.0 lalu dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range
Test dengan taraf 5% untuk mengetahui perbedaan perlakuan yang diberikan