BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
3.4. Metode Kerja
3.4.1. Persiapan Isolat Bakteri B. megaterium
Peremajaan isolat bakteri B. megaterium dilakukan dengan menggunakan media Nutrient Agar. Isolat diambil sebanyak satu ose, kemudian digores pada media NA dalam cawan petri dan diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 28˚C. Pemurnian bakteri dilakukan sampai didapat koloni yang terpisah. Hasil pemurnian diinokulasi ke dalam beberapa media NA pada tabung miring, berfungsi sebagai working culture dan stock culture.
3.4.2. Persiapan Media
Media NA (Nutrient Agar) terdiri dari 0,3 gr ekstrak daging, 0,5 gr bakto pepton dan 1,5 gr agar. Media NA dibuat dengan mencampur semua komponen bahan dengan akuades sesuai volume yang dibutuhkan, kemudian dipanaskan
sambil diaduk sampai homogen. Media NB dibuat dengan cara yang sama namun tanpa agar, kemudian media disterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121o C, tekanan 1 atm.
3.4.3. Persiapan Sediaan Larutan Logam Hg
Sediaan larutan logam Hg (murni) dengan konsentrasi 1000 mg/L dikonversi menjadi 10 mg/L, 15 mg/L dan 20 mg/L dengan teknik pengenceran. Untuk mendapatkan volume logam yang harus dimasukkan ke dalam media NB dalam Erlenmeyer 200 ml sampai mencapai volume total sebesar 40 ml dengan menggunakan rumus persamaan :
V1 = Volume total media dalam Erlenmeyer (40 ml) V2 = Volume larutan logam Hg yang akan digunakan (ml) N1 = Konsentrasi logam Hg yang ditentukan (mg/L) N2 = Konsentrasi logam Hg yang digunakan (1000 mg/L) Perlakuan 1 (Logam 10 mg/L)
V1 . N1 = V2 . N2 40 x 10 = V2 x 1000
V2 = 40 x 10 = 0,4 ml larutan logam sediaan 1000 mg/L 1000
Perlakuan 2 (Logam 15 mg/L) V1 . N1 = V2 . N2 40 x 3 = V2 x 1000
V2 = 40 x 15 = 0,6 ml larutan logam sediaan 1000 mg/L 1000
Perlakuan 3 (Logam 20 mg/L) V1 . N1 = V2 . N2 40 x 3 = V2 x 1000
V2 = 40 x 20= 0,8 ml larutan logam sediaan 1000 mg/L 1000
Kontrol : Media NB yang ditambahkan logam Hg sesuai perlakuan V1 . N1 = V2 . N2
(Tabel 1).
Tabel 1. Perlakuan Pemberian Kultur Inokulum dan Sediaan (Volume total = 40 ml)
Perlakuan Volume Kultur Inokulum Bakteri yang diberikan Volume Larutan Logam Hg (Sediaan) 1 (10mg/L) 4 ml 0,4 ml 2 (15 mg/L) 4 ml 0,6 ml 3 (20 mg/L) 4 ml 0,8 ml Kontrol
Media NB yang ditambahkan larutan logam Hg sesuai masing-masing perlakuan, tanpa inokulum bakteri
3.4.4. Pembuatan Kurva Tumbuh Isolat Bakteri B. megaterium
Sebanyak satu ose isolat bakteri B. megaterium dalam agar miring (working culture) diinokulasi ke dalam 50 ml media NB steril dalam Erlenmeyer, lalu dihomogenkan dengan dikocok dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 24 jam dengan shaker berkecepatan 100 rpm. Selanjutnya kultur tersebut dimasukkan sebanyak 20 ml ke dalam 180 ml NB steril kemudian diukur nilai OD (Optical Density) sel-selnya dengan panjang gelombang 600 nm menggunakan spektrofotometer. Selain itu, jumlah selnya dihitung dengan metode TPC (Total Plate Count) menggunakan spread plate dengan batang L pada cawan petri secara triplo untuk mengetahui jumlah sel per koloni/ml pada jam ke 0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 24. Skema pembuatan pola tumbuh bakteri ditampilkan pada Lampiran 2.
Pembuatan pola pertumbuhan bakteri B. megaterium bertujuan untuk mengetahui waktu pertumbuhan yang optimum dan masa inkubasi terbaik (“tx”)
yang dapat menunjukkan kecepatan pertumbuhan sel tertinggi persatuan waktu (jam) dengan menggunakan rumus kecepatan pertumbuhan (µ) (Fardiaz, 1988):
N0 = jumlah sel awal/ ml
N = jumlah sel/ml setelah waktu t t0 = waktu awal
t = waktu akhir
3.4.5. Persiapan Kultur Inokulum
Sebanyak satu ose isolat Bakteri B. megaterium berumur 24 jam dalam agar miring (working culture) diinokulasi ke dalam 50 ml media NB steril dalam Erlenmeyer, lalu dihomogenkan dengan dikocok dan dinkubasi selama 24 jam dengan shaker berkecepatan 100 rpm.
Sebanyak 20 ml inokulum tadi (10% dari volume total media) di masukkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi media NB sehingga menjadi 200 ml, lalu diinkubasi selama “tx” terbaik atau sampai waktu saat kecepatan pertumbuhan sel bakteri tertinggi dengan shaker berkecepatan 100 rpm. Untuk selanjutnya kultur cair ini digunakan sebagai biang inokulum.
3.4.6. Uji Kemampuan Biosorpsi oleh Isolat Bakteri B. megaterium
Inokulum isolat bakteri diinokulasi ke dalam media steril NB yang berisi logam Hg dengan konsentrasi perlakuan 10, 15 dan 20 mg/L. Volume inokulum bakteri (inokulum biang) yang dimasukkan ke dalam setiap Erlenmeyer adalah
µ = 2,303 ( log N – log N0) t – t0
1/10 (10%) dari volume total media yang telah ditentukan (40 ml), jadi volume inokulum bakteri yang dimasukkan ke dalam tiap Erlenmeyer adalah: 1/10 x 40ml = 4 ml, dengan suhu ruang, shaker berkecepatan 100 rpm dengan waktu inkubasi setelah bakteri diinokulasikan ke dalam media perlakuan adalah setelah tercapai fase kematian. Kemudian kultur diukur konsentrasi logam Hg yang tersisa, sehingga dapat diketahui kemampuan biosorpsinya melalui konsentrasi logam Hg yang terserap.
3.4.7. Pengukuran Biosorpsi Logam Hg oleh Isolat B. megaterium
Sampel disaring dengan kertas saring Whattman menggunakan pompa vakum untuk mendapatkan filtrat sampai volume ±10 ml dalam tabung reaksi bertutup ulir, kemudian cairan filtrat dari setiap perlakuan tersebut ditambahkan 2 tetes HNO3 pekat dan siap untuk dianalisa logamnya pada AAS.
Filtrat yang diperoleh dari hasil pemisahan biomassa isolat diukur konsentrasi logam Hg-nya untuk mengetahui konsentrasi logam Hg yang tidak terserap oleh B. megaterium (yang tersisa di dalam media). Perbedaan konsentrasi logam awal dengan konsentrasi akhir merupakan konsentrasi logam Hg yang terserap oleh B. megaterium (Hancock, 1996).
Pengukuran logam berat Hg pada sampel tersebut dilakukan menggunakan Atomic Absorption Spectrophothometry (AAS) dengan nyala udara asetilen pada panjang gelombang 253,7 nm. Pengukuran konsentrasi logam Hg dilakukan setelah sampel diinkubasi sampai fase kematian.
Karena kisaran konsentrasi Hg dalam sampel perlakuan dan sampel kontrol sekitar 10, 15 dan 20 mg/L atau lebih tinggi maka sebelum sampel
tersebut diukur konsentrasinya pada instrumen AAS Hiranuma Hg-310 Mercury Analyzer dilakukan proses digest (Lampiran 4), dan dilution (pengenceran). Proses dilution dilakukan agar memungkinkan sampel dapat diukur dalam orde nano gram/L, dilution dilakukan dengan menggunakan automatic micropipette eppendorf 10-100 µg/L dan automatic macropipette Socorex 0-5 mL.
Dengan demikian karena sangat sensitif maka proses pemanasan yang terlalu lama (konvensional dengan hot plate ± 2 jam pada 95 ºC) akan menyebabkan hilangnya Hg yang telah didisain hanya dalam konsentrasi orde nano gram/L yaitu 0 s/d 20 nano gram/L) oleh karena itu, dilakukan modifikasi metode seperti yang disarankan Csuros dan Csuros (2002) dengan menggunakan autoklaf dengan waktu pemanasan 30 menit.
Rumus jumlah logam Hg yang terserap (biosorpsi) :
Co = konsentrasi awal logam Hg dalam larutan (mg/L) Ceq = konsentrasi akhir logam Hg dalam larutan (mg/L) Cb = jumlah logam Hg yang terserap (mg/L)
3.4.8. Pengukuran Efisiensi Biosorpsi Logam Hg oleh Isolat B. megaterium Setelah mengetahui konsentrasi logam Hg yang tidak terserap oleh B. megaterium (yang tersisa di media perlakuan) dan konsentrasi akhir logam Hg dalam media kontrol maka dilakukan pengukuran efisiensi biosorpsi oleh bakteri (Joshi, 2003) :
CeqK = konsentrasi akhir logam Hg dalam media kontrol (mg/L) CbP = jumlah logam Hg yang tidak terserap pada perlakuan (mg/L)
Cb = Co - Ceq
R = Ceq K – CbP x 100% Ceq K
