METODE PENELITIAN

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli hingga Desember tahun 2013 di Laboratorium Teknologi Pangan, Laboratorium Analisa Kimia Bahan Pangan, dan Laboratorium Sentral Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara.

Bahan Penelitian

Bahan utama adalah umbi bengkoang varietas gajah dengan umur panen tiga, empat, dan lima bulan. Umbi bengkoang diperoleh dari perkebunan warga di daerah Tanah Merah kota Binjai, Sumatera Utara. Bahan-bahan kimia (reagensia) yang digunakan adalah BHT dan vitamin C sebagai kontrol positif, radikal bebas DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) untuk uji aktivitas antioksidan, n-hexan, metanol, dietil eter, dan akuades untuk ekstraksi senyawa antioksidan serta bahan-bahan untuk analisis proksimat umbi bengkoang seperti NaOH, H2^SO4 ^pekat, K2^SO4^{, dan CuSO}4^.

Alat Penelitian

Pembuatan tepung bengkuang menggunakan oven, blender, dan saringan komersil. Alat untuk ekstraksi senyawa antioksidan meliputi reciprocal mixer

(Denley), erlenmeyer, corong kaca, kertas saring (Whatman No. 41), waterbath, dan corong pisah. Untuk analisis proksimat meliputi neraca analitik (Sartorius), oven (Memmert), tanur, tabung kjeldahl, soxhlet, pendingin balik, labu didih, dan

hot plate. Uji aktivitas antioksidan menggunakan alat spektrofotometer uv-vis (Genesys 200), vortex, pipet volum, dan labu ukur.

Metode Penelitian (Bangun, 2001)

Kegiatan yang dilakukan dalam penelitian ini terdiri dari tiga tahap, yaitu : a. Tahap 1: Pembuatan tepung bengkoang. Tahap 1 pada penelitian ini

menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) nonfaktorial, yaitu: umur panen umbi bengkoang (U) yang terdiri dari 3 taraf, yaitu :

U1 ^{= 3 bulan} U₂ = 4 bulan U3 ^{= 5 bulan}

Setiap perlakuan dibuat dalam 3 kali ulangan

b. Tahap 2: Pembuatan ekstrak metanolik bengkoang. Tahap 2 pada penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) nonfaktorial, yaitu: umur panen umbi bengkoang (U) yang terdiri dari 3 taraf, yaitu :

U1 ^{= 3 bulan} U2 ^{= 4 bulan} U₃ = 5 bulan

Setiap perlakuan dibuat dalam 3 kali ulangan

c. Tahap 3: Uji aktivitas antioksidan ekstrak metanolik bengkoang fraksi eter/air. Pada tahap 3, penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua faktor, yaitu:

Faktor I : Konsentrasi ekstrak metanolik fraksi eter/air (K) yang terdiri dari 5 taraf, yaitu :

K₁ = Konsentrasi 10 ppm K2 ^{= Konsentrasi 20 ppm} K3 ^{= Konsentrasi 40 ppm}

K4 ^{= Konsentrasi 80 ppm} K₅ = Konsentrasi 160 ppm

Faktor II : Umur panen umbi bengkoang (U) yang terdiri dari 3 taraf, yaitu : U1 ^{= 3 bulan}

U₂ = 4 bulan U3 ^{= 5 bulan}

Semua perlakuan dibuat ulangan sebanyak 3 kali. Model Rancangan (Bangun, 1991)

Penelitian ini dilakukan dengan tiga tahap, yaitu : Tahap 1 : Pembuatan tepung bengkoang

Tahap 2: Pembuatan ekstrak metanolik bengkoang

Penelitian tahap 1 dan 2 menggunakan model Rancangan Acak Lengkap (RAL) nonfaktorial dengan model sebagai berikut:

Ŷij ^{= µ +}αi ⁺ εij dimana:

Ŷij ^{: Hasil pengamatan dari faktor U pada taraf ke-i dalam ulangan ke-j} µ : Efek nilai tengah

αi ^{: Efek perlakuan ke-i}

εij ^{: Efek galat perlakuan ke i dengan ulangan ke j}

Apabila diperoleh hasil yang berbeda nyata dan sangat nyata maka uji dilanjutkan dengan uji beda rataan menggunakan Least Significant Range (LSR). Tahap 3: Uji aktivitas antioksidan ekstrak metanolik fraksi eter dan air. Tahap ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dua faktorial dengan model sebagai berikut:

Ŷijk= µ + αi+ βj+ (αβ)ij+ εijk dimana:

Ŷijk ^{: Hasil pengamatan dari faktor K pada taraf ke-i dan faktor U pada taraf} ke-j dalam ulangan ke-k

µ : Efek nilai tengah

αi ^{: Efek faktor K pada taraf ke-i}

βj ^{: Efek faktor U pada taraf ke-j}

(αβ)ij ^{: Efek interaksi faktor K pada taraf ke-i dan faktor U pada taraf ke-j}

εijk ^{: Efek galat dari faktor K pada taraf ke-i dan faktor U pada taraf ke-j} dalam ulangan ke-k

Apabila hasil yang diperoleh berbeda nyata maupun sangat nyata maka uji dilanjutkan dengan uji beda rataan dengan menggunakan uji LSR (Least Significant Range).

Pelaksanaan Penelitian

Pembuatan tepung bengkoang (Rusmarilin, 2003)

Dilakukan peninjauan dan pemilihan umbi bengkoang di lapangan pada umur panen 3, 4, dan 5 bulan. Kemudian umbi bengkoang disortasi, trimming, dan dicuci. Umbi bengkoang diiris untuk mempercepat pengeringan dalam oven. Irisan bengkoang disusun di atas loyang dan dikeringkan dalam oven pada suhu 50^oC dalam waktu 48 jam (sampai kering). Irisan kering bengkoang dihaluskan dengan blender hingga menjadi bubuk/tepung, diayak dengan ayakan komersil. Dilakukan pengemasan dengan plastik dalam keadaan tertutup dan diuji komposisi proksimat tepung bengkoang. Skema pembuatan tepung bengkoang dapat dilihat pada Gambar 5.

Pembuatan ekstrak metanolik bengkoang (Kuncahyo dan Sunardi, 2007) Ekstraksi tepung bengkoang dilakukan untuk memperoleh ekstrak metanolik. Sebanyak 25 g tepung bengkoang dimaserasi dalam pelarut hexan 150 ml (maserasi 48 jam), disaring, dan ampasnya dikeringkan dalam oven dengan suhu 60°C selama 30 menit. Ampas yang telah kering, direndam dalam pelarut metanol sebanyak 150 ml (maserasi 48 jam), dan disaring untuk mendapatkan filtrat metanol. Filtrat atau ekstrak metanol dipekatkan menjadi ekstrak kental metanolik dalam waterbath selama 3 jam dengan suhu 70°C dan dihitung rendemen ekstrak metanolik bengkoang. Skema pembuatan ekstrak metanolik bengkoang dapat dilihat pada Gambar 6.

Pembuatan larutan ekstrak metanolik fraksi eter/air (Kuncahyo dan Sunardi, 2007)

Sebanyak 4 g ekstrak kental metanolik disuspensi dengan 50 ml akuades dan dipartisi dengan 50 ml dietil eter. Digojok selama 30 detik, dan dibiarkan memisah akibat adanya perbedaan massa jenis antara fraksi eter (lapisan atas) dan fraksi air (lapisan bawah). Fraksi eter/air masing-masing dipekatkan dalam

waterbath selama 2 jam dengan suhu 70°C untuk fraksi eter dan 100°C untuk fraksi air. Ekstrak metanolik fraksi eter/air dilarutkan dalam metanol dan dibuat larutan dengan konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, dan 160 ppm. Skema pembuatan larutan ekstrak metanolik fraksi eter/air tersaji pada Gambar 7.

Pengamatan dan Pengukuran Data

Pengamatan dan pengukuran dilakukan melalui analisis menggunakan alat di laboratorium (in vitro). Pada tepung bengkoang dilakukan analisis proksimat, yaitu: pengukuran kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dan kadar

serat kasar. Ekstrak metanolik bengkoang dan ekstak metanolik fraksi eter/air dihitung rendemen dan diukur absorbansi peredaman radikal bebas DPPH pada ekstrak metanolik fraksi eter/air berbagai konsentrasi dan umur panen.

Kadar air, metode oven (SNI 01–2891–1992)

Ditimbang sampel sebanyak 1-2 gram pada botol timbang yang telah diketahui bobotnya. Kemudian dikeringkan dalam oven dengan suhu 105°C selama 3 jam. Didinginkan dalam desikator dan ditimbang, diulangi beberapa kali hingga diperoleh bobot yang tetap. Prinsipnya dengan menghitung jumlah air yang menguap saat dipanaskan dalam oven dan dianggap kadar air yang ada pada bahan. Perhitungannya adalah sebagai berikut :

Kehilangan bobot setelah dikeringkan (g)

Kadar air (% bk) = x 100% Bobot bahan setelah dikeringkan (g)

Kadar abu (Sudarmadji, et al., 1996)

Penentuan kadar abu cara kering, dengan mengoksidasikan semua zat dalam bahan pada suhu tinggi 500-600⁰C. Sampel ditimbang sebanyak 5 g, dimasukkan dalam cawan porselen dan dibakar dalam tanur. Kemudian zat yang tersisa di dalam cawan pengabuan ditimbang. Perbandingan bobot zat sisa (abu) dengan bobot awal sampel (5 g) dinyatakan dalam (%) sebagai kadar abu.

Bobot abu (g)

Kadar abu (%) = x 100% Bobot sampel awal (g)

Kadar serat kasar (Sudarmadji, et al., 1996)

Menentukan banyaknya zat-zat yang tidak larut asam dan basa encer dengan kondisi tertentu. Langkah analisis meliputi penghilangan lemak dan

dan suhu mendidih. Residu yang diperoleh merupakan serat kasar yang mengandung 97% lignin, selulosa, dan senyawa lain yang belum teridentifikasi.

Bobot residu (g)

Kadar serat kasar (%) = x 100%

Kadar protein, cara makro kjeldahl (AOAC, 1995)

Ditimbang sampel yang telah dihaluskan sebanyak 0,2 g, dimasukkan ke dalam labu kjeldahl 30 ml selanjutnya ditambahkan 1,5 ml H₂SO₄ pekat dan 2 g katalis (CuSO4 ^{dan K}2^SO4^{), dan dididihkan selama 2 jam atau sampai berwarna} hijau kebiruan. Labu beserta isinya didinginkan, kemudian isinya dipindahkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan 15 ml larutan NaOH 40%. Kemudian dibilas dengan akuades. Erlenmeyer 250 ml berisi H2^SO4 ^{0,025 N dan 2–4 tetes indikator} mengsel (campuran metil merah 0,02% dalam alkohol dan metil biru 0,02% dalam alkohol dengan perbandingan 2:1) diletakkan di bawah kondensor. Ujung tabung kondensor harus terendam dalam labu berisi campuran larutan H2^SO4 dengan mengsel, kemudian dilakukan destilasi hingga destilat mencapai 125 ml. Ujung kondensor kemudian dibilas dengan sedikit air destilat dan ditampung dalam erlenmeyer lalu dititrasi dengan NaOH 0,02 N sampai terjadi perubahan warna ungu menjadi hijau. Penetapan blanko dilakukan dengan cara yang sama.

(A-B) x N x 0,014 x 5,18

Kadar protein = x 100% Bobot Sampel (g)

A = ml NaOH untuk tittrasi blanko B = ml NaOH untuk titrasi sampel N = Normalitas NaOH

Kadar lemak, metode soxhlet (AOAC, 1995)

Dipanaskan labu alas datar 250 ml di dalam oven pada suhu 105^oC hingga didapat bobot tetap kemudian sampel ditimbang sebanyak 5 gram lalu dimasukkan ke dalam kertas saring. Kertas saring yang berisi sampel diekstrak dengan 130 ml hexan dengan menggunakan soxhlet selama 5 jam dan labu lemak dipisahkan dari alat pengekstraksi lalu diuapkan. Labu dikeringkan dalam oven 60^oC dan ditimbang sampai bobot tetap. Kemudian dihitung kadar lemak sampel dengan rumus :

Bobot akhir labu lemak (g) - Bobot awal labu lemak (g) Kadar lemak (%) = x 100%

Bobot sampel (g) Rendemen (Kuncahyo dan Sunardi, 2007)

Tepung bengkoang 25 g dilarutkan dan direndam (maserasi) dalam pelarut non polar (hexan) 150 ml selama 48 jam. Dilakukan penyaringan, ampas dikeringkan hingga tidak berbau hexan. Residu dilarutkan dalam metanol (maserasi 48 jam) kemudian disaring dan filtrat dipekatkan untuk mendapatkan ekstrak kental metanolik. Ekstrak kental metanolik dihitung rendemennya dengan rumus berikut.

Bobot ekstrak metanolik pekat (g)

Rendemen (%)= x 100% Bobot tepung bengkoang (g)

Sebanyak 4 g ekstrak metanolik disuspensi dengan 50 ml akuades dan dipartisi dengan 50 ml dietil eter. Dilakukan pemisahan fraksi eter dan air. Fraksi eter dipekatkan dengan waterbath pada suhu 70°Cdan fraksi air pada suhu 100°C selama 2 jam. Ekstrak metanolik fraksi eter dan air hasil pemekatan masing-masing ditimbang dan dihitung rendemen dengan rumus sebagai berikut :

Bobot ekstrak metanolik pekat fraksi eter/air (g)

Rendemen (%)= x 100% 4 (g)

Uji aktivitas antioksidan fraksi eter dan air (Kuncahyo dan Sunardi, 2007) Fraksi air dan eter berbagai umur panen masing-masing dibuat larutan induk dengan konsentrasi 160 ppm. Dari larutan induk dibuat larutan dengan konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, dan 80 ppm. Larutan uji (10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, dan 160 ppm) masing-masing sebanyak 4 ml, ditambahkan radikal bebas DPPH 0,1 mM sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam vial dan dikocok. Didiamkan pada suhu kamar selama 30 menit, kemudian dibaca serapan aktivitasnya pada panjang gelombang 517 nm. Blanko yang digunakan adalah 4 ml metanol dan 1 ml DPPH 0,1 mM. Kontrol positif sebagai pembanding digunakan antioksidan sinetetis BHT dan vitamin C. Nilai absorbansi (Abs.) yang diperoleh menunjukkan aktivitas antioksidan senyawa uji (% peredaman). Nilai IC50 ^{masing-masing dihitung dengan persamaan regresi.}

Gambar 5. Skema pembuatan tepung bengkoang Tepung bengkoang

Diayak dengan ayakan komersil Irisan kering diblender hingga menjadi tepung

Disusun di atas Loyang dan keringkan dalam oven suhu 50⁰C selama 48 jam (sampai kering)

Diiris tipis

Disortasi, trimming, dan dan dicuci

Analisis proksimat -Penentuan kadar air -Penentuan kadar abu -Penentuan kadar lemak -Penentuan kadar protein

Penentuan kadar serat kasar Bengkoang

Umur Panen (U) U1 ^{= 3 bulan} U₂ = 4 bulan U3 ^{= 5 bulan}

Gambar 6. Skema pembuatan ekstrak metanolik bengkoang Maserasi dalam pelarut

metanol (1:6) 48 jam Ampas dikeringkan

60⁰C, 30 menit

Disaring Disaring

Maserasi tepung bengkuang dalam pelarut n-hexan (1:6) selama 48 jam

Filtrat metanol

Dipekatkan dengan waterbath

dengan suhu 70°C selama 3 jam

Ekstrak metanolik ^{Penghitungan rendemen} ekstrak metanolik

Gambar 7. Skema pembuatan larutan ekstrak metanolik fraksi eter/air Sebanyak 4 g ekstrak metanolik disuspensi 50 ml akuades dan dipartisi 50 ml dietil eter

Digojok selama 30 detik dan dipisahkan dalam corong pisah

Fraksi eter (lapisan atas), dipekatkan dalam waterbath selama 2 jam dengan

suhu 70 °C, dan dihitung rendemen fraksi kental

Fraksi air (lapisan bawah), dipekatkan dalam waterbath selama 2 jam dengan suhu 100°C, dan dihitung

rendemen fraksi kental Dibuat larutan induk fraksi air

dengan konsentrasi 160 ppm Dibuat larutan induk fraksi eter

dengan konsentrasi 160 ppm

Larutan uji 10, 20, 40 80, dan 160 ppm dianalisis aktivitas antioksidan (% peredaman radikal bebas DPPH)

dengan kontrol positif BHT dan vitamin C

Larutan uji 10, 20, 40 80, dan 160 ppm dianalisis aktivitas antioksidan (% peredaman radikal bebas DPPH)

dengan kontrol positif BHT dan vitamin C

Dari larutan induk dibuat larutan dengan konsentrasi 10,

20, 40, dan 80 ppm

Dari larutan induk dibuat larutan dengan konsentrasi 10,