3.1 Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni 2019 hingga bulan Desember 2019 yang bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Klinis Rumah Sakit USU Medan, Instalasi Laboratorium Mikrobiologi Klinis RSUP H. Adam Malik Medan, Laboratorium Genetika dan Biologi Molekuler Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.2 Metode Penelitian
Penelitian ini menggunakan jenis penelitian deskriptif kualitatif yaitu mengidentifikasi bakteri yang tergolong MDRPA menggunakan Vitek 2 Compact di RS USU Medan dan RSUP H. Adam Malik Medan (Surat Ethical Clearance Lampiran 9, Hlm 53) secara fenotip dan mendeteksi ada atau tidaknya gen resisten
blaIMP, blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2 menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR) secara genotip di Laboratorium Genetika dan Biologi Molekuler FMIPA USU dan Laboratorium Terpadu FK USU. Parameter yang diamati adalah pola sensitivitas antimikroba dan persentase gen resisten blaIMP, blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2 pada isolat klinis bakteri Pseudomonas aeruginosa.
3.3 Preparasi dan Pengoleksian Sampel Klinis
Spesimen klinis yang dikirim ke Unit Mikrobiologi Klinik berupa darah, jaringan, pus, sputum, swab dan urin. Spesimen dilanjutkan ke tahap kultivasi pada media Mac-Conkey Agar. Sampel diinkubasi di dalam inkubator dengan suhu 37 oC selama 24 jam dan ditandai dengan pertumbuhan koloni bakteri yang berwarna coklat kehijauan untuk kemudian dilanjutkan pada tahap identifikasi.
3.4 Identifikasi Bakteri dan Uji Resistensi Terhadap Antibiotik
Tahapan awal dari identifikasi bakteri menggunakan alat Vitek 2 Compact
dilakukan dengan mengambil biakan murni pada media Mac-Conkey Agar lalu dilakukan pewarnaan untuk mengetahui bentuk dari bakteri dan mengelompokkan bakteri berdasarkan gram. Koloni bakteri kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi pertama yang berisi 3 ml NaCl 0,45% pH 5. Suspensi diukur kekeruhannya sesuai dengan standar Mc Farland yaitu 0,5 dengan alat DensiChek. Identifikasi jenis bakteri dilakukan dengan menggunakan kartu identifikasi yaitu Casette GN (Gram Negatif) yang berwarna biru untuk mengidentifikasi secara langsung bakteri gram negatif. Uji resistensi antibiotika dilakukan dengan menggunakan kartu Antimicrobial Susceptibility Testing (AST) yang berwarna abu-abu dimana terdapat 16-20 jenis antibiotik yang terhubung dengan tabung reaksi kedua yang berisi 3 ml 0,45% NaCl dan 145 µl suspensi bakteri dari tabung reaksi pertama. Setiap kartu dilengkapi dengan barcode agar kode sampel muncul pada monitor alat Vitek dan dimasukkan ke dalam Vitek 2 Compact. Hasil akan secara otomatis mengidentifikasi jenis bakteri selama 24 jam (Alur kerja alat Vitek 2 Compact Lampiran 4, Hlm 45).
Isolat yang tergolong MDRPA dengan hasil resistensi terhadap 3 jenis antibiotik atau lebih berdasarkan hasil pemeriksaan Vitek 2 Compact di Unit Mikrobiologi Klinis RS USU dan Instalasi Laboratorium Mikrobiologi Klinis RSUP H. Adam Malik Medan kemudian dilakukan peremajaan isolat. Hasil peremajaan isolat kemudian dibawa ke Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran USU dan Laboartorium Genetika dan Biologi Molekuler untuk pemeriksaan gen resisten
blaIMP, blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2 menggunakan PCR.
3.5 Deteksi Gen Resisten blaIMP, blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2 3.5.1 Isolasi Genom DNA
Isolasi genom DNA dilakukan dengan menggunakan Promega Wizard®
Genomic DNA Purification Kit berdasarkan prosedur Wizard® Genomic DNA Purification Quick Protocol (Alur kerja isolasi DNA Lampiran 5, Hlm 46) yang dimulai dengan pengambilan 2 ose bakteri yang kemudian dimasukkan ke dalam tube sentrifuge 1,5 ml yang berisi 600 µl Nuclei Lysis Solution dan dihomogenkan dengan vortex. Tube sentrifuge diinkubasi pada suhu 80 oC selama 5 menit. Sebanyak 200 µl Protein Precipitation Solution dimasukkan ke dalam tube sentrifuge dan diinkubasi di dalam es selama 5 menit. Hasil dari inkubasi kemudian di sentrifugasi
dengan kecepatan 13.000 xg selama 3 menit. Supernatan dari hasil sentrifugasi dituang ke dalam tube sentrifuge baru berisi 600 µl isopropanol untuk kemudian di sentrifugasi kembali selama 2 menit. Pelet dari hasil sentrifugasi kedua kemudian ditambahkan 600 µl etanol 70% dan disentrifugasi kembali selama 2 menit.
Supernatan yang didapatkan dibuang dan kering-anginkan selama 15 menit dan ditambahkan 50 µl DNA Rehydration Solution dan dihomogenkan. RNAse Solution ditambahkan sebanyak 0,5 µl ke dalam hasil ekstraksi DNA dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 4 oC untuk dilanjutkan ke tahapan selanjutnya.
3.5.2 Pengukuran Kemurnian DNA
Kemurnian DNA dibaca dengan nanophotometer dengan menghitung rasio pada panjang gelombang 260 dan 280 nm sampai didapatkan hasil sebesar 1.8-2.0 yang menunjukkan bahwa DNA bakteri memiliki kemurnian tinggi dan dapat dilakukan amplifikasi menggunakan PCR. DNA dapat diaplikasikan sesuai dengan yang diinginkan atau dapat di simpan pada suhu 4 oC apabila digunakan dalam jangka pendek dan -20 oC apabila digunakan dalam waktu jangka panjang.
3.5.3 Deteksi Gen
Ekstrak DNA digunakan sebagai template untuk PCR dengan primer spesifik yang tercantum dalam Tabel 3.1.
Tabel 3.1 Primer Spesifik Gen blaIMP, blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2
Primer Sequence (5’-3’) Target Gene Product Size (bp) Daftar Pustaka
blaIMP F GAA GGC GTT TAT
Campuran mastermix, primer forward, primer reverse dan Nuclease Free Water dan DNA bakteri dimasukkan ke dalam tube PCR 0,2 ml. Kontrol positif digunakan isolat PU08 yang resisten terhadap karbapenem dan kontrol negatif digunakan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Amplifikasi gen dilakukan dengan kondisi thermocycling gen blaIMP, blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2 sesuai
Elektroforesis dimulai dengan pembuatan gel agarose 2% dengan cara mencampurkan 2 g tepung agarose ke dalam 100 ml Buffer TAE 1x (Lampiran 1, Hlm 42) kemudian di didihkan dan setelah hangat, ditambahkan 1 μl ethidium bromida 1%. Campuran tersebut dihomogenkan di atas magnetic stirer dan dituangkan ke dalam cetakan elektroforesis. Setelah gel agarose mengeras, tambahkan Buffer TAE 1x sampai seluruh gel terendam. Pada well 1 dimasukkan Promega BenchTop DNA Markers 100bp sebanyak 2,5 μl dan 10 μl produk hasil PCR ke dalam well selanjutnya. Cetakan kemudian ditutup sesuai kutub negatif dan positif. Elektroforesis dijalankan dengan dialirkan arus listrik pada 75 v dan 400 mA selama 75 menit. Setelah gel agarose dikeluarkan dari cetakan, masukkan ke dalam alat UV Reader/ Gel Documentation System untuk dilihat visualisasi pola pita DNA dari gen blaIMP, blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2. Pemeriksaan ini adalah tahap akhir identifikasi gen blaIMP, blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2.
3.6 Analisis Data
Data yang diperoleh dari hasil penelitian ini adalah karakteristik pasien MDRPA berdasarkan jenis kelamin, asal spesimen klinis, lokasi perawatan pasien, pola resistensi antibiotik yang meliputi Sensitif (S) dan Resisten (R) dan hasil deteksi gen resisten blaIMP, blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2. Berdasarkan data tersebut, maka data deskriptif akan disajikan dalam bentuk tabulasi, persentase dan pola resistensi antibiotik. Gen resisten blaIMP, blaNDM-1, blaSPM-1, blaVIM-2 disajikan berdasarkan pita DNA.
BAB 4