dengan Variasi Suhu dan Waktu Inkubasi
Ngatirah 1) , Maria Ulfah 1) , Selvi Anggraeni 2)
C. Metode Penelitian
Penelitian ini terdiri dari 3 tahap, tahap pertama yaitu persiapan bahan baku, produksi enzim selulase dan pemanenan enzim selulase kasar. Pada persiapan bahan baku, terdapat tiga persiapan bahan baku yaitu persiapan bahan baku TKKS dengan proses delignifikasi menggunakan metode basa, persiapan larutan mineral Mandel dan persiapan larutan spora jamur T.reesei.
a. Persiapan bahan baku
Persiapan bahan baku TKKS dengan proses delignifikasi
Limbah padat kelapa sawit berupa tandan kosong kelapa sawit (TKKS) diperkecil ukurannya sepanjang ± 4 cm yang selanjutnya dikeringkan menggunakan sinar matahari. Setelah itu diperkecil ukurannya menggunakan alat pencacah kompos (MPO 500 HD Yanmar Engine). Diperkecil ukurannya kembali dengan menggunakan grinder selanjutnya diayak sehingga diperoleh bubuk TKKS dengan ukuran 30 mesh mengacu pada PDII-LIPI (1996). Selanjutnya dilakukan proses delignifikasi sebagai berikut sebanyak 12,5 gram bubuk TKKS, ditambahkan 1 % NaOH sebanyak 100 ml dimasukkan kedalam erlenmeyer.
Selanjutnya di masukkan ke dalam autoklaf dan dipanaskan pada suhu 121 0C dengan tekanan 1 atm selama 1 jam. Selanjutnya langsung disaring pada kondisi panas dan dicuci dengan air mineral ± 70 0C sampai pH air cucian netral. Kemudian dikeringkan
dalam oven selama 24-48 jam pada suhu 60 0C sampai kering yang ditandai dengan apabila dipegang langsung remah (hancur).
Persiapan larutan mineral Mandel
Komposisi larutan mineral Mandel dapat dilihat pada Tabel 1. Pembuatan larutan mineral Mandel dilakukan sebagai berikut: masing-masing bahan ditimbang. Selanjutnya masing-masing dimasukkan kedalam labu takar berukuran 1000 ml. Kemudian ditambah dengan aquadest sampai garis tanda.
Diaduk sampai larut dengan menggunakan magnetik stirer.
Tabel 1. Komposisi larutan mineral Mandel Bahan Kimia Komposisi
Persiapan larutan spora jamur T. reesei
Pertama-tama dilakukan perbanyakan kultur T.reesei dari kultur stock pada media PDA agar miring, dengan cara sebagai berikut: diambil 1 ose spora dalam kultur stock dan kemudian diinokulasi pada media agar miring PDA (cara pembuatan PDA pada lampiran II). Selanjutnya di inkubasi pada inkubator dengan suhu 30 0C selama 1 minggu.
T.reesei dalam agar miring yang telah berumur 1 minggu, ditambahkan aquadest steril sebanyak 5 ml. Selanjutnya spora T. reesei yang berada dipermukaan dikumpulkan dengan menggesek-gesekkan ose pada kultur dipermukaan media.
Setelah spora yang terdapat pada media agar miring terangkat (larut dalam aquadest), larutan spora ditambahkan ke dalam media fermentasi yaitu pada TKKS yang sudah ditambahkan dengan nutrisi dan sudah disterilisasi. Proses persiapan larutan spora ini dilakukan secara aseptis, sehingga tidak terjadi kontaminasi dengan mikroorganisme lain.
b. Produksi enzim selulase kasar
Proses produki enzim selulase kasar dikerjakan berurutan mengacu pada TLUE, urutan pertama yaitu suhu inkubasi 28 0C (S1). Dikerjakan dengan menyiapkan medium fermentasi yang mengandung 28 gram TKKS yang sudah diberi perlakuan pendahuluan (pretreatment) dimasukkan ke dalam gelas piala, dengan ditambahkan nutrisi yang teridiri dari : 2% w/w tepung gandum (2 gram), 35
% v/w aquadest (35 gram) dan 30 % v/w larutan Mandel (30 ml). Selanjutnya media fermentasi selanjutnya diaduk sampai homogen dan
279 disterilisasi pada suhu 121 0C 1 atm selama 15 menit. Setelah dingin, diinokulasi dengan 5 ml larutan spora jamur T. reesei yang sudah dipersiapkan secara aseptis. Kemudian diinkubasi pada waktu yang berbeda selama 2 hari (L1), 4 hari (L2), 6 hari (L3), 8 hari (L4) dan 10 hari (L5).
Setelah semua perlakuan pada ulangan I selesai, dilanjutkan dengan ulangan II dan dilakukan seperti diatas.
c. Pemanenan enzim selulase kasar Setelah waktu inkubasi yang ditentukan tercapai, selanjutnya dilakukan ekstraksi selulase kasar pada masing-masing perlakuan dengan menambahkan 100 ml larutan tween 80 konsentrasi 0,1 %. Setelah ditambah larutan tween, larutan diaduk dengan kecepatan 150 rpm selama 120 menit pada suhu ruang, kemudian dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring sehingga diperoleh filtrat yang mengandung enzim selulase kasar. Filtrat tersebut kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh digunakan sebagai ekstrak enzim kasar. Setelah diperoleh supernatan, dilakukan analisis aktivitas enzim selulase yang meliputi aktivitas endo-glukanase [12] dan ekso-glukanase dengan metode fenol-slufat [9], kadar gula reduksi, serta kadar total nitrogen dengan metode semi kjeldahl [10].
3. HASIL DAN PEMBAHASAN Jumlah jamur Trichoderma reesei
Dari Tabel 1. dapat dilihat bahwa suhu inkubasi tidak berpengaruh terhadap jumlah jamur Trichoderma reesei. Hal ini disebabkan karena kisaran suhu yang digunakan termasuk suhu optimal pertumbuhan jamur T. reesei. Menurut Enari, suhu optimal untuk pertumbuhan kapang ini adalah 32-35 0C dan pH optimal sekitar 4,0 [11].
Penelitian ini dilakukan pada suhu 28-32 0C, sehingga suhu inkubasi masih merupakan suhu optimal pertumbuhan jamur T. Reesei sehingga tidak berpengaruh.
Tabel 1. Jumlah jamur Trichoderma reesei ( x 10 7 CFU/gram) pada kolom maupun lajur menunjukkan
ada beda nyata berdasarkan uji jarak berganda duncan pada jenjang nyata 5%
Lama waktu inkubasi berpengaruh terhadap T.reesei. Makin lama waktu inkubasi jumlah jamur akan makin meningkat. Pada waktu inkubasi 2 hari merupakan fase lag, yaitu fase penyesuaian sel-sel dengan lingkungan. Sedangkan pada waktu inkubasi 4 sampai 10 hari merupakan fase eksponensial, merupakan fase perbanyakan jumlah sel yang sangat banyak. Hingga 10 hari jumlah jamur masih meningkat. Masih perlu waktu inkubasi yang lama lagi untuk mengetahui fase stasioner, yaitu fase jumlah sel yang bertambah dan jumlah sel yang mati relatif seimbang dan fase kematian, dimana jumlah sel-sel yang mati lebih banyak daripada yang masih hidup.
Pada awal fermentasi aktivitas enzim masih sangat rendah. Aktivitas enzim akan meningkat sejalan dengan bertambahnya waktu fermentasi dan menurun pada hari ke-10. Hal ini mengikuti pola pertumbuhan mikroorganisme yang mengalami beberapa fase pertumbuhan yaitu fase adaptasi, fase eksponensial, fase stasioner dan fase kematian.
Organisme pembentuk spora biasanya memproduksi enzim pada fase pasca eksponensial.
Jadi dapat diduga bahwa pada saat aktivitas enzim yang dihasilkan tinggi, maka kapang telah berada pada fase tersebut.
Aktivitas enzim endo-glukanase
Suhu inkubasi tidak berpengaruh nyata terhadap aktivitas enzim endo-glukanase, karena jumlah jamur yang merombak atau mendegradasi selulosa menjadi enzim selulase jumlahnya relatif sama. Hal ini didukung oleh data jumlah jamur pada Tabel 2.
yang menunjukkan bahwa suhu inkubasi tidak berbeda nyata. Pengaruh suhu terhadap enzim ternyata sangat kompleks, misalnya suhu yang terlalu tinggi dapat mempercepat pemecahan atau perusakan enzim. Sebaliknya semakin tinggi suhu (dalam batas tertentu) semakin aktif enzim tersebut.
Bila suhu dinaikkan terus, laju kerusakan enzim akan melampaui reaksi katalis enzim [13].
Tabel 2. Aktivitas enzim endo-glukanase (µ mol glukosa dilepas/menit/ml larutan kultur)
280
Rerata 0,0556 0,0058 0,0329
Keterangan : Rerata yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom maupun lajur menunjukkan ada beda nyata berdasarkan uji jarak berganda duncan pada jenjang nyata 5%
Lama inkubasi berpengaruh terhadap aktivitas endo-glukanase. Pada lama waktu inkubasi selama 4 hari menghasilkan enzim endoglukanase dengan aktivitas paling tinggi. Adanya interaksi antara suhu dan lama inkubasi terhadap aktivitas enzim endoglukanase tertinggi terdapat pada suhu inkubasi 28 0C dengan lama inkubasi selama 4 hari yaitu sebesar 0,0182 µ mol glukosa dilepas/menit/ml larutan kultur. Diduga pada hari ke 4, inkubasi pada suhu 28-32 0C pertumbuhan jamur sudah memasuki fase eksponensial. Dimana pertumbuhan jamur sangat pesat, sehingga enzim yang dihidrolisis juga paling tinggi.
Pada awal fermentasi aktivitas enzim masih sangat rendah. Aktivitas enzim akan meningkat sejalan dengan bertambahnya waktu fermentasi dan menurun pada hari ke-10. Hal ini mengikuti pola pertumbuhan mikroorganisme yang mengalami beberapa fase pertumbuhan yaitu fase adaptasi, fase eksponensial, fase stasioner dan fase kematian.
Organisme pembentuk spora biasanya memproduksi enzim pada fase pasca eksponensial.
Jadi dapat diduga bahwa pada saat aktivitas enzim yang dihasilkan tinggi, maka kapang telah berada pada fase tersebut [14]
Aktivitas enzim ekso-glukanase
Dari Tabel 3. terlihat bahwa suhu inkubasi tidak berpengaruh terhadap aktivitas enzim ekso-glukanase dalam enzim selulase kasar. Hal ini terjadi karena jamur yang digunakan dominan menghasilkan enzim endoglukanase dibanding eksoglukanase sehingga selisih aktivitas enzim dengan berbagai suhu inkubasi relative kecil, sehingga tidak berbeda nyata.
Tabel 3. Aktivitas enzim ekso-glukanase (U/ml)
Waktu pada kolom maupun lajur menunjukkan ada beda nyata berdasarkan uji jarak berganda duncan pada jenjang nyata 5%
Mikrobia selulotik umumnya akan mensekresikan tiga jenis enzim selulase, yaitu endoglukanase atau carboxymethycelullase (CMC-ase), eksoglukanase dan β-glukosidase. Secara sinergis ketiga enzim ini mendegradasi selulosa menjadi glukosa. CMC-ase memecah ikatan hidrogen yang didalam struktur kristalin selulosa.
Eksoglukanase memotong ujung-ujung rantai individu selulosa sehingga menghasilkan disakarida dan tersakarida misalnya selobiosa dan β-glukanase menghidrolisis disakarida dan tersakarida menjadi glukosa [13].
Waktu inkubasi tidak berpengaruh terhadap aktivitas enzim eksoglukanase, namun pada 4 hari inkubasi menghasilkan aktivitas enzim eksoglukanase yang paling tinggi meskipun tidak signifikan. Diduga hal ini karena waktu inkubasi pada 4 hari mikroorganisme sedang memasuki fase eksponensial dimana pertumbuhan jamur sangat pesat. Sehingga enzim yang dihasilkan juga paling tinggi.
Kadar gula reduksi
Pada Tabel 4. menunjukkan bahwa suhu inkubasi berpengaruh nyata terhadap kadar gula reduksi.
Gula reduksi tertinggi terdapat pada suhu inkubasi 30 0C. Hal ini dikarenakan pertumbuhan jamur T.
Reesei paling baik untuk pertumbuhannya yaitu pada suhu 30 0C, dengan jumlah jamur 1,20 x 109, sebagaimana dapat dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Kadar gula reduksi ekstrak enzim selulase kasar (%) pada kolom maupun lajur menunjukkan ada beda nyata berdasarkan uji jarak berganda duncan pada jenjang nyata 5%
Pada perhitungan jumlah jamur Trichoderma reesei, didapat hasil bahwa pada suhu 30 0C menunjukkan pertumbuhan jamur yang paling banyak. Sehingga kandungan gula reduksi yang dihasilkan oleh mikrobia akan semakin banyak.
Jamur yang dihasilkan menghidrolisis selulosa menjadi enzim selulase, dimana enzim selulase terdiri dari tiga enzim penyusunnya, salah satunya
281 adalah enzim β-glukosidase. Enzim β-glukosidase mengurai selobiosa untuk menghasilkan glukosa [13].
Jumlah jamur pada suhu 30 0C menghasilkan jumlah jamur yang tinggi dan dapat menghasilkan enzim β-glukosidase juga tinggi. Sehingga dapat menghasilkan glukosa yang tinggi pula. Hal ini dapat dilihat bahwa pada suhu 30 0C menghasilkan gula reduksi paling tinggi.
Dari Tabel 4. dapat dilihat bahwa waktu inkubasi 4 hari dihasilkan gula reduksi tertinggi sebesar 0,0178 %, meskipun tidak signifikan karena waktu inkubasi pada 4 hari mikroorganisme sedang memasuki fase eksponensial dimana pertumbuhan jamur sangat pesat. Sehingga enzim β-glukosidase yang dihasilkan paling tinggi dan menghasilkan kadar gula reduksi paling tinggi.
4. KESIMPULAN
Suhu inkubasi yang diberikan berpengaruh terhadap kadar gula reduksi, tetapi tidak berpengaruh terhadap jumlah jamur Trichoderma reesei, aktivitas enzim endo-glukanase, aktivitas enzim ekso-glukanase dan kadar total nitrogen.
Waktu inkubasi yang diberikan berpengaruh terhadap jumlah jamur Trichoderma reesei dan aktivitas enzim endo-glukanase, tetapi tidak berpengaruh terhadap kadar gula reduksi, aktivitas enzim ekso-glukanase dan kadar total nitrogen.
Pengaruh suhu dan waktu inkubasi terbaik berdasarkan aktivitas enzim endo-glukanase tertinggi diperoleh pada perlakuan dengan suhu inkubasi 28 0C dengan waktu inkubasi selama 4 hari yaitu dengan jumlah jamur Trichoderma reesei sebanyak 1,30 x 106 CFU/gram, aktivitas enzim endo-glukanase sebesar 0,0182 µ mol glukosa dilepas/menit/ml, aktivitas enzim ekso-glukanase 0,3002 U/ml, kadar gula reduksi sebesar 0,0187 % dan kadar total nitrogen sebesar 0,6829 %.
DAFTAR PUSTAKA
[1] Deptan, “Pedoman Pengelolaan Limbah Industri Kelapa Sawit”. Subdit Pengelolaan Lingkungan,
Ditjen PPHP, Deptan. 2006
http://www.agribisnis.deptan.go.id. [25 November 2012].
[2] Loebis B. dan Tobing P.L. “Potensi pemanfaatan limbah kelapa sawit” Buletin Perkebunan, No. 20, 1989, hal 49-56.
[3] Tun Tedja Irawadi. “Produksi Enzim ekstraselular (Selulase dan Xylanase) dari Neurospora sitophilada Substrat Limbah Kelapa Sawit”. Disertasi. Fakultas Pascasarjana IPB, Bogor, 1991.
[4] Ngatirah, Maria Ulfah, Mustofa AR dan selvi A.
“Pretreatment Limbah Biomassa Kelapa Sawit
Dengan Berbagai Metode Delignifikasi”.
Prosiding seminar nasinal PATPI, 2013.
[5] Muchtadi D., S.R Palupi dan M. Astawan,
“Enzim dalam Industri Pangan”, PAU Pangan dan Gizi IPB, Bogor, 1992.
[6] Gunam I. B. W. dan Antara N. S. “Study on Sodium Hydroxide Treatment of Corn Stalk to Increase Its Cellulose Saccharification Enzymatically by Using Culture Filtrate of Trichoderma reesei”. Gitayana, Agric. Technol.
J, No. 5 (1), 1999, hal 34-38
[7] Adney B. and Baker J. “Measurement of Cellulose Activities, CO: National Renewable Energy Laboratory report“. NREL/TP-51-42628, 1996.
[8] Miettinen A, “Trichoderma reesei Strains for Production of Cellulase for the Textile Industry”. Anal. Chem. No. 31, 2004, hal 425 – 430
[9] Kamila L. “Pencirian Selulotik Isolat Khamir Rhodotorula sp. dari Tanah Hutan Taman Nasional Gunung Halimun”. Skripsi. Jurusan Kimia. IPB, Bogor, 2003.
[10] Sudarmadji S., B. Haryono. Dan Suhardi,
“Prosedur Analisa Bahan Makanan”. Penerbit Liberty, Yogyakarta, 1984.
[11] Enari, TM. “Microbial Cellulose”. Di dalam W.M. Fogarty (ed.) Microbial Enzyme and Biotechnology Applied Science Published, New York, 1983.
[12] Sadler J.N. “Screening of Highly Cellulolytic Fungi and The Action of Their Cellulase Enzyme System”. Enzyme Microbiology Technology No. 4, 1982 hal 414 – 418
[13] Winarno, F.G.,”Enzim Pangan”. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta, 1995
[14] Anwar N. A. Widjaja., dan S. Winardi.
“Peningkatan Unjuk Kerja Hidrolisis Enzimatik Jerami Padi Menggunakan Campuran Selulase Kasar dari Trichoderma reesei dan Aspergillus niger”, Institut Teknologi Sepuluh November.
Makara. Sains, No. 14(2), 2010, hal 113-116.
282