METODOLOGI PENELITIAN
3.3 Metode Penelitian
Gambar 10 Sonde lambung dan spoit. Gambar 11 Antibiotik Clavamox®.
3.3 Metode Penelitian
3.3.1 Persiapan Laboratorium dan Kandang
Penelitian ini diawali dengan pengadaan peralatan dan fasilitas tempat tinggal untuk mencit seperti box plastik, tutup jaring, botol minum, dispenser, tempat pakan, kain alas, sikat, sarung tangan, spoit 1 ml, hanger, dan timbangan digital. Pakan yang akan diberikan kepada mencit ditimbang dan dibungkus ke dalam plastik. Tiap ekor mencit baik betina maupun jantan diberi pakan 5 g tiap ekornya dan air minum yang ad libitum. Pengadaan mencit sebanyak 72 ekor dilakukan setelah semua alat dan fasilitas lengkap.
3.3.2 Adaptasi dan Perlakuan pada Mencit
Aktivitas penelitian setelah proses persiapan dan pengadaan alat dan bahan, yaitu membersihkan box plastik, mencuci botol, mengganti air minum dua hari sekali, memberi pakan, dan mengganti kain alas pada box plastik. Kain yang digunakan sebagai alas pada box plastik dicuci setiap hari. Mencit yang baru datang diistirahatkan selama dua hari agar dapat beradaptasi dengan kandang baru. Mencit-mencit kemudian diberi pretreatment berupa anthelmintik Albendazole 5% dengan dosis 10 mg/kg bobot badan. Pemberian anthelmintik ini dilakukan sehari (single dose). Mencit dicekok antibiotik Clavamox 25 mg/ kg bobot badan selama 5 hari. Pretreatment selanjutnya adalah mencit dicekok anti protozoa Flagyl dengan dosis 30 mg/kg bobot badan selama 5 hari (Hrapkiewiez dan Mediana 2007).
Gambar 12 Mencit saat adaptasi kandang.
Mencit-mencit dibagi menjadi empat kelompok setelah pretreatment. Satu kelompok terdiri dari 9 ekor mencit betina dan 9 ekor mencit jantan. Kelompok 1 sebagai kelompok kontrol yang dicekok aquadest 0.1 ml/ekor/hari. Kelompok 2 sebagai kelompok dosis preventif yang dicekok ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.1 ml/ekor/hari. Kelompok 3 sebagai kelompok dosis kuratif yang dicekok ekstrak minyak jintan hitam sebanyak 0.2 ml/ekor/hari. Kelompok 4 dicekok ekstrak minyak jintan hitam kombinasi madu dengan dosis sebanyak 0.3 ml/ekor/hari. Pemberian ekstrak minyak jintan hitam dan kombinasinya dengan madu pada mencit berlangsung selama 2 bulan. Penentuan dosis dilakukan
berdasarkan aturan pakai pada kemasan sediaan ekstrak minyak jintan hitam komersial yang telah dikonversikan pada bobot badan mencit.
Gambar 13 Mencit saat perlakuan. Keterangan (A) di-handling saat akan dicekok, (B) dicekok dengan ekstrak minyak jintan hitam.
3.3.3 Nekropsi dan Pembuatan Preparat Histologi
Mencit-mencit dieuthanasi menggunakan metode dislokasio os atlas-ocipitale lalu dinekropsi untuk melihat gambaran patologi anatomi organ pencernaan mencit. Kadaver mencit diamati apabila ada kelainan patologinya secara makroskopis. Organ lambung dan usus halus dipisahkan dari organ lainnya. Organ-organ tersebut difiksasi dalam larutan BNF 10% selama 24-48 jam dan diberi nomor kode protokol.
Gambar 14 Prosedur euthanasi pada mencit.
Sampel jaringan kemudian di-trimming atau dipotong kecil setebal 0.5 cm dan dimasukkan ke dalam tissue cassette untuk dilakukan proses dehidrasi di dalam seri larutan alkohol dengan konsentrasi bertingkat (70%, 80%, 90%, dan 96%), alkohol absolut I, II, dan III masing-masing selama 2 jam. Proses dilanjutkan dengan clearing atau penjernihan. menggunakan xylol I, II, dan III masing-masing selama 40 menit. Proses selanjutnya adalah embedding ke dalam parafin I, parafin II, parafin III, dan parafin IV masing-masing selama 30 menit. Proses berlangsung secara otomatis di dalam Sakura®automatic tissue processor. Sampel organ yang telah berbentuk blok parafin disimpan dalam lemari es (suhu 4-6ºC) untuk mengeraskan parafin dan memudahkan pemotongan (sectioning) menggunakan mikrotom dengan ketebalan 4-5µm. Preparat diberi kode protokol sesuai dengan nomor protokol pada spesimen. Hasil potongan berupa pita (ribbon) dimasukkan dengan pinset ke dalam air yang telah dihangatkan (45C). Hasil potongan diangkat dari permukaan air dengan object glass. Tahap selanjutnya adalah dilakukan pengeringan dan dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 60C selama semalam.
Pewarnaan jaringan mengunakan Haematoxylin-Eosin (HE) dan Periodic Acid Schiff (PAS). Tahap awal pewarnaan HE adalah deparafinisasi dan rehidrasi. Sediaan lalu direndam dalam Mayer’s haematoxylin selama 8 menit dan dibilas dengan air mengalir selama 30 detik. Sediaan direndam dengan lithium karbonat selama 15-30 detik lalu dibilas dengan air mengalir selama 2 menit. Perendaman dalam Eosin selama 2-3 menit lalu dibilas dengan air selama 30-60 detik. Teknik pewarnaan PAS, yakni sediaan yang sudah dideparafinisasi kemudian dicelupkan ke dalam asam asetat 1% selama 5 menit, sediaan dibilas dengan aquadest selama 5 menit. Sediaan dioksidasi ke dalam periodic acid 1% selama 5-10 menit dan dibilas dengan aquadest sebanyak tiga kali. Sediaan kemudian dimasukkan ke dalam Schiff reagent kira-kira 15-30 menit, dibilas dengan air sulfit sebanyak tiga kali, masing-masing pembilasan dilakukan selama 2 menit. Kemudian sediaan dibilas dengan air mengalir selama 10-15 menit dan dibilas dengan aquadest. Selanjutnya sediaan didehidrasi sampai dengan xylol. Setelah proses pewarnaan selesai, kemudian sediaan ditetesi perekat permount dan ditutup dengan gelas penutup lalu dikeringkan.
3.3.4 Pengamatan Preparat Histologi
Proses pengamatan preparat digunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 200x dan 400x (20x dan 40x lensa objektif serta 10x lensa okuler) dan digital electronic eyepiece camera. Organ yang diamati adalah lambung bagian fundus dan usus halus bagian duodenum dengan luasan 240 000 µm2. Pengamatan pada lambung dilakukan untuk mengamati sel-sel jaringan lambung mulai dari lumen hingga lapisan serosa seperti jumlah sel chief, sel parietal, sel mukus permukaan dan sel radang. Pengamatan pada duodenum terdiri dari tinggi vili, jumlah kripta, sel goblet, dan sel radang pada lapisan mukosa. Data kuantitatif diperoleh menggunakan perangkat lunak Image J sebanyak 10 lapang pandang. Selain itu terdapat data bobot badan mencit yang dihitung tiap minggu saat sebelum dan setelah perlakuan. Hasil perhitungan parameter-parameter tersebut dapat dijadikan indikator dari efek pemberian ekstrak minyak jintan hitam maupun kombinasinya dengan madu terhadap gambaran histologi organ lambung dan usus halus mencit.