A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli sampai September 2012 bertempat di Laboratorium Stasiun Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Lampung dan Laboratorium Jurusan Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: timbangan digital, gelas ukur,
blender, vortex (BOECO, GermanyTM), mikropipette (Nesco®), autoklaf, vacum
evaporator (Heidolph), lemari es, jangka sorong 0,05 mm, lampu bunsen, inkubator, cawan petri 150 x 15 mm (Normax®), tabung reaksi 5 ml (Iwaki
glassTM), erlenmeyer 500 ml dan 250 ml (Pyrex®), spreader, pipet tetes, jarum
ose, magnetic stirer, hot plate (Stuart CB162TM), aluminium foil, plastik tahan panas, kertas kopi, kapas steril, kertas label, masker, karet gelang, sarung tangan, pisau, korek api, kertas saring, kertas cakram, saringan, tisu, corong, mikroskop,
wadah penetasan Artemia salina, lampu, spektrofotometer (Genesys-20,
Thermospectronic), kamera digital, dan alat tulis.
18
Sedangkan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah inokulum
murni bakteri A. hydrophila, E. tarda, S. iniae, dan P. stutzeri, ekstrak buah
Rhizophora sp., kista Artemia salina, media TSA (Trypticase Soy Agar)
(OXOID®), media TSB (Trypticase Soy Broth) (OXOID®), media MHB
(Mueller-Hilton Broth) (OXOID®), alkohol 70%, metanol, heksan, etil asetat dan aquades steril.
C. Metode Penelitian
Pelaksanaan penelitian terbagi menjadi 2 tahap, yaitu:
1. Tahap Persiapan a. Sterilisasi Alat
Sterilisasi merupakan usaha yang dilakukan untuk membebaskan alat dan bahan dari mikroorganisme kontaminan. Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara mencuci alat dan bahan yang akan digunakan sampai bersih. Setelah kering, alat-alat dibungkus menggunakan kertas kopi, hal ini bertujuan untuk mencegah alat-alat tersebut terkena air, selanjutnya masukan alat-alat tersebut
ke dalam autoklaf dengan suhu 1210C, tekanan 1 atm selama 15-20 menit.
b. Pembuatan Ekstrak
Pembuatan ekstrak dilakukan dengan menggunakan metode maserasi. Buah dicuci sampai bersih kemudian dikeringkan pada suhu ruangan sampai kering, selanjutnya buah dihaluskan dengan blender dan diayak dengan saringan sampai didapatkan bubuk halus.
Proses ekstraksi dilakukan dengan melarutkan 500 gram bubuk buah
19
masing-masing sebanyak 2500 ml. Kemudian hasil maserasi disaring
dengan menggunakan kertas saring dan dievaporasi menggunakan vacum
evaporator dan didapatkan ekstrak buah Rhizophora sp.
c. Penyiapan Bakteri Uji
Bakteri uji yang akan digunakan pada penelitian ini adalah E. tarda, S.
iniae, dan A. hydrophila yang berasal dari Laboratorium Hama dan Penyakit Ikan, Strasiun Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Lampung.
2. Tahap Pelaksanaan a. Uji Sensitivitas
Uji sensitivitas bertujuan untuk mengetahui potensi antibakteri yang terkandung
di dalam ekstrak buah Rhizophora sp. dengan konsentrasi 100 % yang dilarutkan
menggunakan 3 pelarut berbeda terhadap bakteri A. hydrophilla, E. tarda, P.
stutzeri, dan S. iniae. Uji sensitivitas dilakukan dengan menggunakan metode
difusi (Diffusion Test) menggunakan kertas cakram. Hasil uji aktivitas antibakteri
dengan metode kertas cakram ditunjukkan dengan adanya zona bening di sekitar
kertas cakram. Sebanyak 20 isolat cair bakteri uji masing – masing dengan
kepadatan 107 cfu/ml diinokulasikan pada media TSA dan diratakan dengan
spreader. Kertas cakram dengan diameter 6 mm yang telah direndam di dalam
ekstrak buah Rhizophora sp yang dilarutkan dengan 3 jenis pelarut berbeda
(heksana, etil asetat dan methanol) selama 15 menit, kemudian diletakkan pada permukaan media TSA, lalu media TSA diinkubasi selama 18-24 jam. Pengamatan Uji sensitivitas dilakukan dengan melihat zona hambat ekstrak buah
20
Rhizophora sp. yang terbentuk terhadap bakteri A. hydrophilla, E. tarda, P. stutzeri, dan S. iniae. Hasil dari uji sensitivitas yang menunjukkan diameter terbesar dari 1 pelarut ke 1 bakteri yang akan dipakai di dalam uji zona hambat.
b. Uji Zona Hambat
Uji zona hambat dilakukan dengan menggunakan metode difusi (Diffusion Test)
menggunakan kertas cakram. Uji zona hambat dilakukan berdasarkan hasil dari uji
sensitivitas ekstrak buah Rhizophora sp. yang menunjukan potensi antibakteri.
Sebanyak 20 isolat cair bakteri yg ditentukan dari uji sensitivitas dengan hasil
diameter zona hambat terbesar dengan kepadatan 107 cfu/ml diteteskan pada
media TSA lalu diratakan dengan spreader. Kertas cakram dengan diameter 6
mm yang telah direndam di dalam ekstrak buah Rhizophora sp. pada konsentrasi
100, 200, 300, 400, 500 dan 600 mg/l selama 15 menit, kemudian diletakkan pada permukaan media TSA. Kontrol positif dilakukan dengan memberikan
kertas cakram berisi antibiotik oxytetracycline, sedangkan kontrol negatif berupa
kertas cakram netral (hanya diberi akuades). Setelah masa inkubasi, kemudian diamati dan diukur diameter zona hambat yang terbentuk di sekitar kertas cakram tersebut dengan jangka sorong.
c. Uji MIC (Minimum Inhibitory Concentration)
Uji MIC dilakukan berdasarkan hasil uji zona hambat. Uji MIC bertujuan untuk
mencari konsentrasi terendah bahan anti bakteri yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Metode Penentuan MIC langkah awal yang dilakukan yaitu disiapkan tabung reaksi steril dan dimasukkan 4,5 ml media MHB ke dalam
21
100, 200, 300, 400, 500, 600 mg/l dan kontrol, kontrol positif berupa antibiotik
oxytetracyline, sedangkan kontrol negatif hanya diberi bakteri, dimasukkan sebanyak 0,5 ml ke dalam masing-masing tabung reaksi. Kemudian suspensi
bakteri uji dengan kepadatan 107 cfu/ml sebanyak 0,1 ml ditambahkan kedalam
masing-masing tabung reaksi dan divortek hingga homogen. Media MHB diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Hasil pengamatan dibandingkan dengan larutan pembanding (larutan MHB dicampur ekstrak buah Rhizophora tanpa ditambah bakteri) sehingga dapat diketahui adanya media yang mulai bening/jernih yang menunjukkan nilai MIC. Nilai-nilai MIC ditafsirkan sebagai pengenceran tertinggi dan konsentrasi terendah (Wilson, 2005).
Pengamatan uji MIC dilakukan dengan melihat kekeruhan media MHB yang
telah diberi ekstak buah Rhizophora sp.
d. Uji MBC (Minimum Bactericidal Concentration)
Penentuan MBC dapat dilakukan setelah menginokulasikan larutan dari tabung MIC terjernih pada media. Diambil 0,1 ml suspensi bakteri dari tabung pada perlakuan yang menunjukkan nilai MIC sampai konsentrasi sebesar 100%, kemudian ditumbuhkan dalam medium TSA. Diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Setelah diinkubasi, dihitung jumlah koloni yang tumbuh pada medium TSA. Nilai MBC ditentukan dari konsentrasi terendah ekstrak yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan koloni pada cawan petri. Pengamatan uji MBC dilakukan dengan melihat konsentrasi terendah ekstrak yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan koloni pada cawan petri.
22
e. Uji Toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test)
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Uji Toksisitas dengan Metode BSLT digunakan untuk
mempelajari toksisitas sampel secara umum dengan menggunakan Artemia salina.
Penetasan Kista A. salina.
Wadah berbentuk kerucut disiapkan untuk penetasan kista A. salina. Lampu
diletakkan di atas wadah untuk menghangatkan suhu dalam penetasan. Wadah
diisi air laut dan diberi aerasi, kemudian dimasukan kista A. salina sebanyak 1 gr.
Lampu dinyalakan selama 48 jam untuk menetaskan kista. Setelah menetas larva
A. salina diambil dengan pipet.
Persiapan Larutan Sampel yang akan diuji.
Larutan sampel yang akan diuji dibuat dengan perbandingn 0,5 : 1 : 1,5 : 2 : 2,5 : 3 kali dari konsentrasi hasil terbaik uji MIC.
Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT.
Larutan sampel yang akan diuji masing-masing perbandingan konsentrasi 0,5 : 1 : 1,5 : 2 : 2,5 : 3. Setiap konsentrasi dilakukan 3 kali pengulangan. Kontrol dilakukan tanpa penambahan sampel. Penambahan larutan ekstrak dan air laut
sampai volume 2 ml. Larva A. salina dimasukkan masing-masing 20 ekor dengan
menggunakan pipet ke dalam wadah uji. Larutan dibiarkan selama 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva yang hidup dan mati dari tiap perlakuan.
Selanjutnya dihitung mortalitas A. salina. Grafik dibuat dengan log konsentrasi
sebagai sumbu x terhadap mortalitas sebagai sumbu y. Nilai LC50 merupakan
23
memakai persamaan regresi linier y = a + bx. Suatu zat dikatakan aktif atau toksik
bila nilai LC50 < 1000 ppm untuk ektrak (Juniarti, 2011).
= ℎ 100%
f. Uji Inhibition Time Course
Uji inhibition time course bertujuan untuk melihat waktu ekstrak Rhizopora sp.
dapat menghambat bakteri. Langkah awal dalam uji inhibition time course
pertama membuat media TSB dengan aquades steril, dimasukan kedalam tabung erlemayer masing – masing sebanyak 50 ml, kemudian ekstrak dimasukan kedalam masing – masing tabung erlenmayer sehingga dosis ekstrak menjadi 1
MIC, 2 MIC, dan 3 MIC, dengan kontrol positif menggunakan oxytetracyline, dan
kontrol negatif tanpa pemberian antibiotik. Kemudian, sebanyak 50 µl dengan
kepadatan 105 sel/ml inokulasi bakteri yang telah disiapkan 1 hari sebelumnya
dimasukan kedalam erlenmayer. Pengamatan dilakukan setiap 3 jam selama 24 jam, pengamatan dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer. Pengamatan Uji Inhibition Time Course dilakukan dengan menghitung kepadatan bakteri dengan menggunakan alat spektrofotometer.
✂ ✄☎ESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Dari hasil penelitian maka dapat disimpulkan bahwa:
1. ekstrak buah Rhizophora sp. memiliki respon hambat yang lemah dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. iniae, dan melalui uji toksisitas menunjukkan ekstrak buah Rhizophora sp. bersifat toksik sehingga tidak dapat digunakan pada uji In vivo.
2. uji Inhibition Time Course selama 24 jam belum menunjukan waktu ekstrak
buah Rhizophora sp. dalam menghambat pertumbuhan bakteri S. iniae
B. Saran
1. Perlu dilakukan uji fitokimia untuk mengetahui kandungan bahan alami yang
terdapat pada buah Rhizophora sp. sehingga dapat dieksplorasi potensinya lebih jauh.
2. Perlu dilakukan perbaikan pada proses pengeringan bahan dan metode ekstraksi, seperti bahan sediaan untuk ekstraksi, dan tingkat kehalusan sediaan ekstraksi.
3. Perlu penambahan waktu dalam uji Inhibition Time Course ekstrak buah
DAFTAR PUSTAKA
Aryanti, 2004. Isolasi Senyawa Antikanker Dari Tanaman Keladi Tikus (Typhonium divaricatum L. Decne). Jurnal Bahan Alam Indonesia ISSN 1412-2855 Vol.3(2): 188-190.
Baiano, Justice C.F. and Andrew C. Barnes. 2009. Towards Control Of Streptococcus iniae. Emerging Infectious Diseases. Vol. 15(12): 1891-1896 p.
Bisharat, Naiel, Tatiana Gorlachev and Yoram Keness. 2012. 10-Years Hospital Experience In Pseudomonas stutzeri and Literature Review. The Open Infectious Disease Journal, 6: 21-24 p.
Bromage, E.S, A. Thomas, and L. Owens. 1999. Streptococcus iniae, A Bacterial Infection In Barramundi Lates calcalifer. Disease Of Aquatic Organisms. Vol. 36: 177-181p.
Bryan, Sheri-Ann J. 1999. Starvation Responses of Pseudomonas Stutzeri. Thesis. Seton Hall University.
Buchanan, John T., Kelly M. Colvin, Mike R. Vicknair, Silpa K. Patel, Anjuli M. Timmer, and Victor Nizet. 2008. Strain-Associated Virulence Factors Of Streptococcus iniae In Hybrid-Striped Bass. Veterinary Microbiology 131: 145-153p.
Budyanto, Ponco, dan Joni Kusnadi. 2012. Formulasi Edible Film Antibacterial Active Packaging Dengan Penambahan Ekstrak Antibakteri Daun Jati. Jurnal. Universitas Brawijaya, Malang.
Damayanti, Ema., dan T.B. Supardjana. 2007. Efek Penghambatan Beberapa Fraksi Ekstrak Buah Mengkudu Terhadap Shigella dysenteriae. Prosiding Semnas Teknik Kimia. Universitas Jendral Soedirman. Purwokerto
Gardenia, Lila, Isti Koesharyani, Hambali Supriyadi, dan Tatik Mufidah. 2010. Aplikasi Deteksi Aeromonas hydrophila Penghasil Aerolysin Dengan Menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Jurnal Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur. Hal: 877-883.
Guasp, Caterina, Edward R.B. Moore, Jorge Lalucat, and Antonio Bennasar.
40
The Definition of Pseudomonas stutzeri Genomovars and Other
Pseudomonas Species. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology. Great Britain. 50: 1629–1639p.
Hardhianto, Mochammad Dwi, Boedi S. Rahardja, dan Gunanti Mahasri. 2010. Efektivitas Bakteri Pseudomonas Sebagai Pengurai Bahan Organik (Protein Karbohidrat, Lemak) Pada air Limbah Pembenihan Ikan Lele Dumbo (Clarias sp.) Sistem Sirkulasi Tertutup. Abstrak Tesis.
Herupradoto, B. A, dan Gandul Atik Yuliani. 2010. Karakterisasi Protein Spesifik Aeromonas hydrophila Penyebab Penyakit Ulser Pada Ikan Mas. Jurnal
Veteriner Vol. 11 No. 3: 158–162.
Irwanto. 2008. Hutan Mangrove dan Manfaatnya. Ambon.
Irwanto. 2006. Keanekaragaman Fauna pada Habitat Mangrove. Yogyakarta. Janda, J. Michael and Sharon L. Abbott. 2010. The Genus Aeromonas: Taxonomy,
Pathogenicity, and Infection. Clinical Microbiology Review Vol.23 (1): 35-73.
Jayavignesh, V., K. Sendesh Kannan, and Abhijith D. Bath. 2011. Biochemical Characterization and Cytotoxicity of The Aeromonas hydrophila Isolated From Catfish. Archives of Applied Science Research Vol 3 (3): 85-93. Juliantina, F., Dewa Ayu C.M., Bunga Nirwani, Titis Nurmasitoh, dan Endrawati
Tri Bowo. 2009. Manfaat Sirih Merah (Piper crocatum) Sebagai Agen Antibakterial Terhadap Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. Jurnal Kedokteraan dan Kesehatan Indonesia.
Juniarti, Delvi Osmeli, dan Yuhernita. 2009. Kandungan Kimia, Uji Toksisitas
(Brine Shrimp Lathalitytest) Dan Antioksidan
(1,1-diphenyl-2-pikrilhydrazyl) Dari Ekstrak Daun Saga (Abrus precatorius L.). Makara Sains Vol.13(1): 50-54.
Locke, J.B., Kelly M. Colvin, Nissi Varki, Mike R. Vicknair, Victor Nizet, and John T. Buchanan. 2007. Streptococcus iniae B-Hemolysin Streptolysin S Is A Virulence Factor In Fish Infection. Disease of Aquatic Organisms. Vol.76: 17-26.
Masibo, M. and He, Q. 2009. In Vitro Antimicrobial Activity and The Major Polyphenol In Leaf Extract of Mangifera indica L. Malaysian Journal of Microbiology. Vol.5(2): 73-80.
Nadirah, M., Najiah M., and Teng S.Y. 2012. Characterization of Edwardsiella tarda Isolated From Asian Seabass, Lates calcalifer. International Food Research Journal 19(3): 1247-1252.
41 Noor, Y.R., M. Khazali, dan I N.N. Suryadiputra. 2006. Panduan Pengenalan
Mangrove di Indonesia. PHKA/WI-IP. Bogor
Park, Seong Bin, Takashi Aoki, and Tae Sung Jung. 2012. Pathogenesis of and Strategies for Preventing Edwardsiella tarda Infections In Fish. Veterinary Research, 43:67
Pelczar MJ, and Chan ECS. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi 2. Hadioetomo RSi Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL. Penerjemah. Jakarta: UI Press. Terjemahan dari : Elements of Microbiology.
Pier GB, Madin SH. 1976. Streptococcus iniae sp. nov., a betahemolytic
streptococcus isolated from an Amazon freshwater Dolphin, Inia
geoffrensis. International Journal of Systematic bacteriology 26 (4): 545-53. Purnobasuki, Hery. 2004. Potensi Mangrove Sebagai Tanaman Obat. Biota IX
(2): 125-126.
Purwaningsih, Uni dan Taukhid. 2010. Vaksin Anti Streptococcus spp. Inaktivasi Melalui Heatkilled Untuk Pencegahan Penyakit Streptococcosis Pada Ikan
Nila (Oreochromis niloticus). Prosiding Forum Inovasi Teknologi
Akuakultur. Hal.: 901-904
Rahayu, I.D. 2008. Produksi Antibiotik Alami Hasil Isolasi Aloe barbadensis
Miller :Penanggulangan Mastitis pada Sapi Perah. Laporan Penelitian
Hibah
Ramachandran, T., Rajendrakumar K., dan Rajendran R., 2004. Antimicrobial
Textiles–an Overview. IE (I) Journal. Vol.84: 42-47.
Rinawati. N. D., 2011. Daya Antibakteri Tumbuhan Majapahit (Cresentia cujete L.) Terhadap Bakteri Vibrio Alginolyticus. Tugas Akhir Program Studi Biologi ITS. Surabaya.
Rohaeti, E., Batubara, I., Lieke, A., dan Darusman, LK. 2010. Potensi Ekstrak Rhizophora sp. Sebagai Inhibitor Tirosinase. Prosiding Semnas Sains III. IPB. Bogor.
Sari, D.K. 2008. Penapisan Antibakteri dan Inhibitor Topoisomerase I dari Xylocarpus granatum. Tesis. ITB. Bogor
Setyawan, A.D., Ari Susilowati, dan Sutarno. 2002. Biodiversitas Genetik, Spesies dan Ekosistem Mangrove Di Jawa. Petunjuk Praktikum Biodiversitas; Studi Kasus Mangrove. Penerbit Kelomppok Kerja Biodiversitas Jurusan Biologi FMIPA. UNS. Surakarta
42 Soeroyo dan Suyarso. 2000. Kondisi Dan Inventarisasi Hutan Mangrove Di
Kawasan Teluk Lampung. Puslitbang Oseanografi. LIPI. Hal. 95-102
Suada, I Ketut. 2012. Keragaman Aktivitas Antifungi Biota Laut Terhadap Fusarium oxysporum f.sp. vanillae Penyebab Busuk Batang Vanili. Jurnal Bumi Lestari, Vol. 12 (1): 66-70.
Sukardjo, Sukristijono. 1984. Ekosistem Mangrove. Oseana. Volume IX (4): 102-115.
Tan, Y.P., Q. Lin, X.H. Wang, S. Joshi, C.L. Hew, and K.Y. Leung. 2002. Comparative Proteomic Analysis of Extracellular Proteins of Edwardsiella tarda. Infections and Immunity Vol.70(11): 6475-6480.
Trianto A. Wibowo, E. Suryono, dan Sapta R. 2004. Ekstrak daun mangrove Aegiceras corbiculatum sebagai antibakteri Vibrio harveyi dan vibrio parahaemolyticus. Ilmu kelautan 9(4):186-189.
Underwood, J.C.E. 2006. Patologi Umum dan Sistematik. Penerjemah: Prof. Dr. Sarjadi, dr., SpPA. Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Weinstein, M.R., Margaret Litt, Daniel A. Kertesz, Phyllis Wyper, David Rose, Mark Coulter, Allison McGeer, Richard Facklam, Carola Ostach, Barbara M. Willey, Al Borczyk, and Donald E. Low. 1997. Invasive Infections Due To A Fish Pathogen, Streptococcus iniae. The New England Journal of Medicine Vol.337(9): 589-594.
Wyatt, L.E., Ranzell Nickelson II, and Carl Vanderzant. 1979. Edwardsiella tarda In Freshwater Catfish and Their Environment. Applied and Environmental Microbiology Vol.38(4): 710-714.