Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap yaitu, pengambilan dan preparasi sampel, identifikasi sampel, pengolahan dan penentuan konsentrasi garam dengan menggunakan uji hedonik. Remis selanjutnya dianalisis proksimat meliputi kadar air, abu, lemak, protein serta analisis asam lemak dan kolesterol. Diagram alir penelitian disajikan pada Gambar 7.
Gambar 7 Diagram alir metode penelitian
Keterangan : = Input/output
= Proses = Data
3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel
Pengambilan sampel remis dilakukan di perairan Situ Gede, Bogor. Remis tersebut kemudian dipreparasi untuk menentukan rendemen. Metode yang digunakan untuk perhitungan rendemen ini berdasarkan persentase bobot bagian
Remis
Perhitungan rendemen Identifikasi
Perebusan dalam air garam 0,5%, 1%, 1,5%,
2% 7-10 menit
Pengujian organoleptik
Pengukuran ukuran & bobot
Uji proksimat
Uji asam lemak
Uji kolesterol Penambahan garam 1,5% Perebusan 7-10 menit Pengukusan 12-15 menit Daging segar
tubuh remis dari bobot remis awal. Perumusan matematika rendemen adalah sebagai berikut:
Rendemen % =Bobot contoh (g)
Bobot total (g) � 100%
3.3.2 Metode Pengolahan
Penelitian ini menggunakan 3 metode pengolahan yaitu pengukusan, perebusan dan perebusan dalam air garam. Penelitian pendahuluan sebelumnya telah dilakukan untuk menentukan lamanya waktu perebusan dan pengukusan yang paling baik. Remis yang dikukus akan matang pada suhu 100 0C selama 12-15 menit, sedangkan yang direbus akan matang pada suhu 100 0C selama 7-10 menit. Pada perlakuan perebusan dalam air garam dilakukan uji organoleptik untuk mengetahui konsentrasi garam terbaik. Konsentrasi garam yang akan diuji hedonik (uji kesukaan) parameter rasa yaitu 0,5 %, 1%, 1,5 % dan 2 % (b/v).
Tahapan uji hedonik (SNI 2346-2011) yaitu sampel disajikan dengan memberikan kode nomor secara acak dan panelis sebanyak 30 orang akan memberikan penilaian tingkat kesukaan terhadap rasa dari remis. Uji skala hedonik dilakukan berdasarkan tingkat kesukaan panelis dalam 9 skala kesukaan (1= amat sangat suka, 2=sangat tidak suka, 3=tidak suka, 4=agak tidak suka, 5=netral, 6=agak suka, 7=suka, 8=sangat suka, 9=amat sangat suka) (Lampiran 2). 3.3.3 Analisis proksimat
Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia yang ada pada suatu bahan. Analisis proksimat terhadap remis meliputi : analisis kadar air, abu, protein, dan lemak.
1) Analisis kadar air (AOAC 2005)
Prinsip dari analisis kadar air yaitu untuk mengetahui kandungan atau jumlah air yang terdapat pada suatu bahan. Tahap pertama yang dilakukan pada analisis kadar air adalah mengeringkan cawan porselen dalam oven pada suhu 105 0C selama 1 jam. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator (kurang lebih 15 menit) dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Sampel seberat 1 gram ditimbang setelah terlebih dahulu digerus. Selanjutnya cawan yang telah diisi
sampel tersebut dimasukkan ke dalam oven suhu 102 0C-105 0C selama 5-6 jam. Cawan tersebut dimasukkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin (30 menit) kemudian ditimbang.
Perhitungan kadar air pada daging remis:
% Kadar air = B−C
B−A � 100%
Keterangan : A = Berat cawan kosong (gram)
B = Berat cawan yang diisi dengan sampel (gram)
C = Berat cawan dengan sampel yang sudah dikeringkan (gram) 2) Analisis kadar abu (AOAC 2005)
Prinsip dari analisis kadar abu yaitu untuk mengetahui jumlah abu yang terdapat pada suatu bahan terkait dengan mineral dari bahan yang dianalisis. Cawan abu porselen dibersihkan dan dikeringkan di dalam oven bersuhu sekitar 105 0C selama 30 menit. Cawan abu porselen tersebut dimasukkan ke dalam cawan abu porselen. Selanjutnya dibakar di atas kompor listrik sampai tidak berasap dan dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dengan suhu 600 0C selama 7 jam. Cawan dimasukkan di dalam desikator sampai dingin dan kemudian ditimbang.
Perhitungan kadar abu pada daging remis:
% Kadar abu = C−A
B−A � 100%
Keterangan : A = Berat cawan kosong (gram)
B = Berat cawan dengan daging remis (gram)
C = Berat cawan dengan daging remis setelah dikeringkan (gram) 3) Analisis kadar protein (AOAC 1995)
Prinsip dari analisis protein, yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar (crude protein ) pada suatu bahan. Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi.
1) Tahap destruksi
Daging remis ditimbang seberat 1 gram kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldah. Setengah butir kjeltab dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan
ditambahkan 10 ml H2SO4. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 400 0C. Proses destruksi dilakukan sampai larutan menjadi bening.
2) Tahap destilasi
Hasil destruksi diencerkan dengan akuades hingga 100 ml dengan labu takar. Air dipanaskan sampai mendidih di heater rangkaian alat destilator. Asam borat sebanyak 25 ml dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Erlenmeyer tersebut kemudian dipasang pada tempatnya (di tempat pengeluaran sampel NaOH). Hasil destruksi (larutan sampel) dipipet sebanyak 10 ml juga dimasukkan ke dalam desikator. Setelah itu, larutan NaOH 50 % sebanyak 10 ml juga dimasukkan ke dalam destilator. Setelah larutan di dalam erlenmeyer yang berisi asam borat berubah warna menjadi biru kehitaman atau hijau toska, erlenmeyer diangkat dan dilakukan proses titrasi.
3) Tahap Titrasi
Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,0947 N sampai terjadi perubahan warna menjadi warna (warna asam borat semula). Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut:
% Nitrogen = ml HCl sampel−ml HCl blanko x N HCl x 14
mg daging remis x 100%
% Kadar protein = % Nitrogen x faktor konversi(6,25) 4) Analisis kadar lemak (AOAC 2005)
Daging remis seberat 3 gram (W1) dimasukkan ke dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya (W2) dan disambungkan dengan tabung soxhlet. Selongsong lemak dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung soxhlet dan disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet lalu dipanaskan pada suhu 40 0C dengan menggunakan pemanas listrik selama 16 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut akan tertampung di ruang ekstraktor, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu
105 0C, setelah itu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan (W3).
Perhitungan kadar lemak pada daging remis:
% Kadar Lemak = W3−W2
W1 � 100%
Keterangan : W1 = Berat sampel remis (gram)
W2 = Berat labu lemak tanpa lemak (gram) W3 = Berat labu lemak dengan lemak (gram) 3.3.4 Analisis asam lemak (AOAC 1999)
Metode analisis yang digunakan memiliki prinsip mengubah asam lemak menjadi turunannya, yaitu metil ester sehingga dapat terdeteksi oleh alat kromatografi. Gas chromatography (GC) memiliki prinsip kerja pemisahan antara gas dan lapisan tipis cairan berdasarkan perbedaan jenis bahan (Fardiaz 1989). Jenis alat kromatografi gas yang digunakan dalam penelitian ini adalah Shimadzu GC 2010. Hasil analisis akan terekam dalam suatu lembaran yang terhubung dengan rekorder dan ditunjukkan melalui beberapa puncak pada waktu retensi tertentu sesuai dengan karakter masing-masing asam lemak. Sebelum melakukan injeksi metil ester, terlebih dahulu lemak diekstraksi dari bahan lalu dilakukan metilasi sehingga terbentuk metil ester dari masing-masing asam lemak yang didapat.
a) Ekstraksi asam lemak
Tahap pertama dilakukan ekstraksi soxhlet untuk memperoleh asam lemak,dan ditimbang sebanyak 20-30 mg lemak dalam bentuk minyak.
b) Pembentukan metil ester (metilasi)
Tahap metilasi dimaksudkan untuk membentuk senyawa turunan dari asam lemak menjadi metil esternya. Asam-asam lemak diubah menjadi ester-ester metil atau alkil yang lainnya sebelum disuntikkan ke dalam kromatografi gas (Fardiaz 1989). Metilasi dilakukan dengan merefluks lemak di atas penangas air dengan menambahkan 1 ml NaOH 0,5 N ke dalam metanol dan dipanaskan selama 20 menit. Selanjutnya ditambahkan 2 ml BF3 16 % kemudian dipanaskan kembali selama 20 menit dan didinginkan. Tahap selanjutnya, 2 ml NaCl jenuh dan 1 ml isooktan ditambahkan pada sampel, dihomogenkan, lalu bagian atas lapisan isooktan ke dalam tabung reaksi yang
berisi 0,1 gram Na2SO4 anhidrat dan dibiarkan 15 menit. Larutan disaring dengan mikrofilter untuk memisahkan fase cairnya sebelum diinjeksikan ke dalam kromatografi gas. Sebanyak 1 μl sampel diijeksikan ke dalam Gas Chromatography. Asam lemak yang ada dalam metil ester akan diidentifikasi oleh flame ionization detector (FID) atau detector ionisasi nyala dan respon yang ada akan tercatat melalui kromatogram (peak).
c) Identifikasi dengan kromatografi gas
Identifikasi asam lemak dilakukan dengan menginjeksikan metil ester pada alat kromatografi gas dengan kondisi sebagai berikut: jenis alat kromatografi gas yang digunakan adalah Shimadzu GC 2010, gas yang digunakan sebagai fase bergerak adalah gas nitrogen dengan aliran bertekanan 20 ml/menit dan sebagai gas pembakar adalah hidrogen dengan aliran bertekanan 30 ml/menit dan oksigen dengan aliran 200-300 ml/menit, kolom yang digunakan adalah kolom kapiler (capillary column) yang panjangnya 60 cm dan diameter dalam 0,25 mm dengan tebal lapisan film 0,25 µm. Temperatur terpogram yang digunakan adalah suhu 125 0C yang dipertahankan 515 menit, kemudian suhu dinaikkan hingga suhu akhir 225 0C yang dipertahankan 20 menit, suhu injektor 220 0C dan suhu detektor 230 0C. Alat kromatografi gas yang digunakan dalam analisis dapat dilihat pada Gambar 8.
(a) (b)
Kondisi alat GC pada saat analisis sebagai berikut :
a) Jenis Kolom : Cyanopropil methyl sil (capillary column) b) Panjang kolom : 60 cm
c) Diameter dalam : 0,25 mm d) Tebal lapisan film : 0,25 µm e) Laju alir N2 : 20 ml/menit f) Laju alir H2 : 30 ml/menit g) Laju alir udara : 200-250 ml/menit h) Suhu injektor : 220 0C
i) Suhu detektor : 230 0C j) Suhu terpogram : 125 - 225 0C d) Perhitungan jumlah asam lemak
Prinsip analisis komposisi asam lemak dengan kromatografi gas adalah dengan mengubah komponen asam lemak pada lemak/minyak menjadi senyawa volatil metil ester lemak yang akan dideteksi oleh detektor ionisasi nyala api dalam bentuk respon berupa peak kromatogram. Jenis dan jumlah asam lemak yang ada pada contoh dapat diidentifikasi dengan membandingkan peak kromatogram contoh dengan peak kromatogram asam lemak standar yang telah diketahui jenis dan konsentrasinya, kemudian dihitung kadar asam lemaknya. Pada pengujian asam lemak digunakan metode eksternal standar dimana contoh dan standar dilakukan secara terpisah, tidak ada penambahan larutan standar ke dalam contoh. Kadar asam lemak sampel dengan metode eksternal standar dapat dihitung sebagai berikut:
Asam lemak =
Area sampel
Area standar x C standar x
V contoh
100 x 100 % gram contoh
3.3.5 Analisis kolesterol dengan spektrofotometer
Analisis kadar kolesterol dilakukan menggunakan spektrofometer. Sampel remis sebanyak ± 0,1 gram sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge ditambah 8 ml (etanol : petroleum benzena) dengan perbandingan 3 : 1 dan diaduk
sampai homogen. Pengaduk dibilas dengan 2 ml larutan alkohol : petroleum benzena ( 3:1) kemudian disentrifuge 4000 rpm selama 10 menit.
Supernatan dituang ke dalam beaker glass 100 ml dan diuapkan di penangas air. Residu dilarutkan dengan kloroform sedikit demi sedikit sambil dituangkan ke dalam tabung berskala (sampai volume 5 ml) dan ditambahkan 2 ml acetic anhidrid ditambahkan juga 0,2 ml H2SO4 pekat atau 2 tetes. Selanjutnya dihomogenkan dengan vortex dan dibiarkan di tempat gelap selama 15 menit. Lalu dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotemeter pada panjang gelombang 420 nm yang ditunjukkan dengan warna hijau tua.
Kadar kolesterol dalam sampel dihitung dengan rumus :
Kadar Kolesterol = Absorbansi contoh Absorbansi standar x
Konsentrasi standar bobot contoh
3.3.6 Rancangan percobaan dan analisis data 1) Analisis data uji hedonik
Konsentrasi garam untuk proses perebusan dalam air garam ditentukan dengan menggunakan uji hedonik. Data hasil uji hedonik dianalisis menggunakan Kruskal Wallis distribusi uji Chi Square. Apabila nilai x2 hitung > x2 tabel maka tolak Ho (perbedaan konsentrasi garam tidak memberikan pengaruh nyata terhadap parameter rasa remis). Prosedur pengujian Kruskal Wallis menggunakan rumus sebagai berikut (Steel dan Torrie 1993):
(1) H = 12 n(n+1)
∑
Rini2−
3(n + 1) (2) FK = ∑T n−1 n(n+1) (3) H’ = H FKKeterangan ni = banyaknya pengamatan tiap perlakuan atau jumlah panelis N = banyaknya data
Ri = jumlah rata-rata tiap perlakuan ke-i
T = banyaknya pengamatan yang seri dalam tiap ulangan H’ = H terkoreksi
Apabila hasil uji Chi Square menunjukkan di antara perlakuan tersebut memberikan pengaruh nyata terhadap rasa remis maka pengujian dilanjutkan
dengan uji Multiple Comparison dengan rumus sebagai berikut (Steel dan Torrie 1993):
′ − ; >< / ( −1) �(�+ 1) 12 1 � + 1 � Keterangan :
R’i = rata-rata rangking perlakuan ke-i R’j = rata-rata rangking perlakuan ke-j N = banyaknya data
K = banyaknya perlakuan ni = jumlah data perlakuan ke-i nj = jumlah dat perlakuan ke-j
2) Rancangan percobaan kandungan proksimat, asam lemak dan kolesterol Rancangan percobaan yang digunakan untuk menguji pengaruh metode pengolahan terhadap komposisi proksimat, kandungan asam lemak dan kolesterol adalah rancangan acak lengkap (RAL) dengan satu faktor dan 4 taraf (sampel segar, pengukusan, perebusan dan perebusan dalam air garam). Data dianalisis dengan ANOVA (Analysis Of Variant) menggunakan uji F, sebelum dilakukan uji F terlebih dahulu di uji kenormalan data.
Uji kenormalan data menggunakan uji Kolmogrov Simirnov (Steel dan Torrie 1993). Kurva normal yang dihasilkan pada uji Kolmogrov Simirnov disertakan dengan nilai rata dan standar deviasi (simpangan baku). Nilai rata-rata menggambarkan posisi kurva sumbu X, sedangkan standar deviasi menggambarkan sebaran varian. Koefisien keragaman dengan nilai dibawah 50 % (median) dinyatakan cukup baik karena dapat membuktikan pada tingkat 95 %.
Suatu data dapat menyebar normal pada : x ‒ z α/2√��
< �<
x + z α/2σ√n (Walpole 1992) Koefisien keragaman = σ
Keterangan: x = rata-rata z = 1,96
µ = (1-α) 100 % � = simpangan baku n = banyak data
Model rancangan analisis ANOVA (Analysis Of Variant) atau uji F adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie 1993):
Yij = μ + τi + εij Keterangan :
Yij = Nilai pengamatan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j (j=1,2) μ = Nilai tengah atau rataan umum pengamatan
τi = Pengaruh metode pengolahan pada taraf ke-i (i=1,2,3) εij = Galat atau sisa pengamatan taraf ke-i dengan ulangan ke-j
Hipotesa terhadap data hasil uji komposisi proksimat pada berbagai metode pengolahan adalah sebagai berikut:
H0 = Metode pengolahan tidak memberikan pengaruh terhadap komposisi proksimat. H1 = Metode pengolahan memberikan pengaruh terhadap komposisi proksimat.
Hipotesa terhadap data hasil analisis asam lemak pada berbagai metode pengolahan adalah sebagai berikut:
H0 = Metode pengolahan tidak memberikan pengaruh terhadap asam lemak. H1 = Metode pengolahan memberikan pengaruh terhadap asam lemak.
Hipotesa terhadap data hasil analisis kolesterol pada berbagai metode pengolahan adalah sebagai berikut:
H0 = Metode pengolahan tidak memberikan pengaruh terhadap kolesterol. H1 = Metode pengolahan memberikan pengaruh terhadap kolesterol.
Jika uji F pada ANOVA memberikan pengaruh yang berbeda terhadap komposisi kimia, asam lemak dan kolesterol maka dilanjutkan dengan uji Duncan, dengan rumus sebagai berikut:
Duncan = tα/2; dbs 2� � Keterangan :
KTS = Kuadrat tengah sisa dbs = Derajat bebas sisa r = Banyaknya ulangan