BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
2. Optimasi metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
a. Pembuatan buffer fosfat. Buffer dibuat dengan melarutkan 7,5 gram Na2HPO4 dalam 500 mL akuabides. Nilai pH kemudian dibuat sampai 3,2 dengan asam asetat glassial p.a menggunakan alat potensiometer. Dan kemudian ditambah aquabidest hingga 1000 ml. Buffer fosfat harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan fase gerak buffer : metanol (90 : 10). Fase gerak yang digunakan dalam penelitian menggunakan campuran buffer dan metanol dengan perbandingan 90 : 10. Fase gerak dibuat dalam labu takar 1,0 liter kemudian digojog dan disaring dengan penyaring Whatman anorganik dengan bantuan pompa vakum. Fase gerak kemudian didegassing selama 15 menit.
c. Pembuatan larutan baku parasetamol dan fenobarbital.
1) Pembuatan larutan stok dan intermediet parasetamol. Parasetamol ditimbang lebih kurang 50,0 mg secara seksama, dimasukkan dalam labu ukur 10 ml, dilarutkan dengan 3 ml metanol p.a, kemudian ditambah buffer fosfat pH 3,2 hingga tanda. Larutan stok diambil 5,0 ml, dimasukkan dalam labu ukur 10,0 ml, kemudian diencerkan dengan buffer fosfat pH 3,2 hingga tanda (larutan intermediet).
2) Pembuatan larutan stok fenobarbital. Natrium fenobarbital ditimbang lebih kurang 55,0 mg secara seksama, yang setara dengan 50,24 mg fenobarbital, dimasukkan dalam labu ukur 25,0 ml, dilarutkan dengan 5 ml metanol p.a, kemudian ditambah dengan buffer fosfat pH 3,2 hingga tanda.
3) Pembuatan seri kurva baku parasetamol. Larutan intermediet parasetamol diambil sebanyak 0,28 ml dan 0,56 ml, dan larutan stok parasetamol diambil sebanyak 0,42; 0,56; dan 0,70 ml. Masing-masing larutan tersebut kemudian diencerkan dengan buffer fosfat pH 3,2 dalam labu takar 10 ml hingga tanda dan didapatkan 5 seri baku yaitu 0,07; 0,14; 0,21; 0,28 dan 0,35 mg/ml. Seri baku parasetamol disaring dengan milipore dan didegassing selama 15 menit. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
4) Pembuatan seri kurva baku fenobarbital. Larutan stok fenobarbital diambil sebanyak 2,3; 2,8; 3,4; dan 4 ml. Masing-masing larutan tersebut kemudian diencerkan dengan buffer fosfat pH 3,2 dalam labu takar 5 ml hingga tanda. Sedangkan seri ke-5 menggunakan larutan stok. Seri baku fenobarbital disaring dengan milipore dan didegassing selama 15 menit. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali.
d. Penetapan panjang gelombang pengamatan antara parasetamol dan fenobarbital dengan spektrofotometer UV. Parasetamol dan fenobarbital masing-masing ditimbang lebih kurang 10,0 mg secara seksama, dimasukkan dalam labu takar 10 ml, dilarutkan dengan 3 ml metanol p.a, kemudian ditambah buffer fosfat pH 3,2 hingga tanda. Larutan stok diambil sebanyak 50, 70 dan 90 µl, dimasukkan dalam labu takar 10 ml, kemudian diencerkan dengan buffer fosfat pH 3,2 hingga tanda. Larutan ini dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 200-300 nm dengan spektrofotometer UV. Spektra parasetamol dan fenobarbital ditumpangtindihkan
untuk mengetahui panjang gelombang pengamatan pada deteksi dengan KCKT fase terbalik.
e. Pengamatan waktu retensi parasetamol dan fenobarbital baku. Larutan parasetamol baku dengan konsentrasi 0,21 mg/ml dan larutan fenobarbital baku dengan konsentrasi 1,5 mg/ml disaring dengan milipore dan didegassing selama 15 menit. Kemudian sebanyak 50,0 µl larutan disuntikkan ke dalam sistem KCKT yang telah dioptimasi.
f. Pembuatan persamaan kurva baku parasetamol. Sebanyak 50,0 µl masing-masing seri larutan baku disuntikkan ke dalam sistem KCKT yang telah dioptimasi. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali, dipilih persamaan kurva baku parasetamol yang paling baik.
g. Pembuatan persamaan kurva baku fenobarbital. Sebanyak 50,0 µl masing-masing seri larutan baku disuntikkan ke dalam sistem KCKT yang telah dioptimasi. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali, dipilih persamaan kurva baku fenobarbital yang paling baik.
3. Uji keseragaman kandungan zat aktif pulveres A secara KCKT
Sebanyak satu bungkus pulveres A ditimbang secara seksama, dimasukkan dalam labu ukur 10,0 ml, dilarutkan dengan 3,0 ml metanol p.a, kemudian ditambah buffer fosfat pH 3,2 hingga tanda. Larutan sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge, ditutup dengan parafilm, dan disentrifuge selama 10 menit, kecepatan 3500 rpm. Larutan ini selanjutnya disebut larutan X dan digunakan untuk menetapkan
konsentrasi fenobarbital. Sebanyak 125 µl larutan X diambil, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 ml dan diencerkan dengan buffer hingga tanda, selanjutnya larutan ini disebut larutan Y dan digunakan untuk menetapkan konsentrasi parasetamol. Larutan X dan Y disaring dengan milipore dan didegassing selama 15 menit. Kemudian sebanyak 50,0 µl larutan disuntikkan ke dalam sistem KCKT dengan kolom ODS (5 mm x 30 cm), menggunakan perbandingan fase gerak buffer : metanol (90:10) dan kecepatan alir 1,5 ml/ menit. Waktu retensi sampel kemudian diamati.
4. Optimasi Metode Spektrofotometri Ultraviolet dengan Aplikasi Panjang Gelombang Berganda
a. Pembuatan larutan baku ketotifen fumarat dan siproheptadin HCl. Ketotifen fumarat dan siproheptadin HCl masing-masing ditimbang lebih kurang 10,0 mg secara seksama, dimasukkan dalam labu ukur 10,0 ml, dan dilarutkan dengan metanol p.a hingga tanda. Selanjutnya, masing-masing larutan tersebut diambil sebanyak 0,100; 0,125; 0,150; 0,175; 0,200; 0,225; dan 0,250 ml, kemudian dimasukkan dalam labu ukur 10,0 ml. Larutan tersebut diencerkan dengan metanol p.a hingga tanda sehingga diperoleh larutan baku ketotifen fumarat dan siproheptadin HCl masing-masing dengan seri konsentrasi 10,00; 12,50; 15,00; 17,50; 20,00; 22,50; dan 25,00 ppm.
b. Penentuan panjang gelombang pengamatan. Tiga seri konsentrasi larutan ketotifen fumarat dan siproheptadin HCl yang telah dibuat, masing-masing diukur absorbansinya pada rentang panjang gelombang 220-380 nm. Pada spektra serapan
ketotifen fumarat dan siproheptadin HCl yang diperoleh, ditentukan panjang gelombang yang akan digunakan dalam penelitian yaitu 7 panjang gelombang yang berada pada daerah tumpang tindih antara spektra serapan tersebut. Panjang gelombang ini adalah panjang gelombang pengamatan yang akan digunakan untuk mengukur serapan seri konsentrasi baku dan larutan sampel.
c. Penentuan daya serap ketotifen fumarat dan siproheptadin HCl. Seri larutan baku ketotifen fumarat dan siproheptadin HCl yang telah dibuat masing-masing diukur serapannya pada 7 panjang gelombang pengamatan yang telah dipilih. Kemudian, harga daya serap ketotifen fumarat dan siproheptadin HCl pada masing-masing panjang gelombang pengamatan dihitung dengan menggunakan persamaan regrasei linier. Harga daya serap pada masing-masing panjang gelombang merupakan koefisien regresi (b) dari persamaan regresi Y = bX + a; dimana Y adalah harga, X adalah konsentrasi (ppm), dan a adalah konstanta.
5. Uji keseragaman kandungan zat aktif pulveres B secara spektrofotometri ultraviolet berganda
Sebanyak satu bungkus pulveres B ditimbang secara seksama, dimasukkan dalam labu ukur 10,0 ml, dilarutkan dengan metanol p.a hingga tanda. Larutan sampel dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge, ditutup dengan parafilm, dan disentrifuge selama 10 menit, kecepatan 3500 rpm. Sebanyak 2400 µl larutan yang telah disentrifuge diambil, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 ml dan diencerkan dengan buffer hingga tanda, kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang pengamatan yang telah dipilih. Kemudian dilakukan perhitungan konsentrasi
ketotifen fumarat dan siproheptadin HCl berdasarkan serapancampuran dengan menggunakan persamaan matriks.
F. Analisis Hasil
1. Analisis hasil pengujian keseragaman kandungan pulveres A
a. Luas area kromatogram (AUC = Area Under The Curve) dari berbagai seri baku digunakan untuk membuat kurva baku menggunakan persamaan regresi linear y = bx + a yang merupakan hubungan antara konsentrasi dengan luas area yang dihasilkan.
b. Penetapan konsentrasi parasetamol dan luminal dalam sampel menggunakan persamaan kurva baku yang diperoleh, dengan memasukkan AUC yang diperoleh sebagai y.
c. Konsentrasi parasetamol dan fenobarbital hasil perhitungan selanjutnya dibandingkan secara deskriptif dengan ketentuan uji keseragaman kandungan menurut Farmakope Indonesia IV.
2. Analisis hasil pengujian keseragaman kandungan pulveres B
a. Konsentrasi ketotifen fumarat dan siproheptadin HCl hasil perhitungan persamaan matriks digunakan untuk menghitung konsentrasi ketotifen fumarat dan siproheptadin HCl dalam sampel pulveres.
b. Konsentrasi ketotifen fumarat dan siproheptadin HCl hasil perhitungan selanjutnya dibandingkan secara deskriptif dengan ketentuan uji keseragaman kandungan menurut Farmakope Indonesia IV.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengambilan Sampel
Pada proses produksi, pulveres A dan B dibuat dengan penggerusan dan pencampuran serbuk dalam jumlah banyak secara sekaligus. Sehingga, uji keseragaman kandungan zat aktif bertujuan untuk mengetahui keseragaman kadar zat aktif dalam pulveres A dan pulveres B rumah sakit X. Uji ini dilakukan untuk menjamin kualitas dan keamanan pulveres ketika digunakan pada pasien anak rumah sakit X.
Menurut Farmakope Indonesia IV, keseragaman sediaan dapat dilakukan dengan salah satu dari dua metode, yaitu keragaman bobot atau keseragaman kandungan. Persyaratan keragaman bobot dapat ditetapkan pada produk yang mengandung zat aktif 50 mg atau lebih yang merupakan 50 % atau lebih dari bobot satuan sediaan. Keseragaman zat aktif jika ada dalam jumlah lebih kecil ditetapkan dengan persyaratan keseragaman kandungan.
Pada etiket, fenobarbital pada pulveres A terdapat dalam jumlah kecil yaitu 15 mg. Pada etiket pulveres B tertulis bahwa kandungan ketotifen fumarat adalah sebesar 0,5 mg dan kandungan siproheptadin adalah 1 mg dalam tiap pulveres. Jumlah zat aktif pulveres A dan B tersebut terdapat dalam jumlah kecil kurang dari 50 mg, maka digunakan persyaratan keseragaman kandungan.
Pada penelitian ini, sampel yang digunakan merupakan dua jenis pulveres anak yang paling sering digunakan di Rumah Sakit X. Pulveres A memiliki perbandingan 11.11:1 yaitu 166,7 mg parasetamol dan 15 mg fenobarbital. Pulveres B memiliki perbandingan 1:2 yaitu 0,5 mg ketotifen fumarat dan 1 mg siproheptadin HCl. Pada penelitian ini, setiap satuan pulveres dalam 1 batch yang sama memiliki kesempatan yang sama untuk diambil sebagai sampel (random) pada pengujian keseragaman kandungan.
B. Uji Keseragaman Kandungan Pulveres A secara KCKT
1. Optimasi metode KCKT
Penelitian ini mengacu pada penelitian Lissanta (2008) mengenai optimasi penetapan kadar campuran parasetamol dan fenobarbital dengan metode KCKT yang memiliki akurasi, presisi, dan liniearitas yang baik, nilai LOD parasetamol dan fenobarbital secara berturut – turut adalah 0,006 mg/ml dan 0,124 mg/ml, dan nilai LOQ parasetamol dan fenobarbital secara berturut – turut adalah 0,020 mg/ml dan 0,414 mg/ml.
Sistem KCKT fase terbalik tersebut adalah: Instrumen : Shimadzu LC-10 AD
Kolom : C18 merk Waters Bondapac dengan panjang kolom 30 cm No. P61271B02
Kecepatan alir : 1,5 ml/menit
AUFS/Attenuation : 0,01/7 untuk fenobarbital dan 0,01/9 untuk parasetamol
Detektor : UV pada 236 nm
Sistem kromatografi ini adalah kromatografi partisi fase terbalik. Alasan pemilihan sistem ini adalah senyawa yang digunakan yaitu parasetamol dan fenobarbital bersifat polar dan larut dalam pelarut yang lebih polar seperti air, metanol, dan asetonitril. Dengan demikian, fase gerak yang digunakan lebih polar dibandingkan fase diamnya. Fase gerak tersebut adalah campuran fase gerak metanol dan buffer fosfat pH 3,2. Sedangkan fase diam yang digunakan lebih nonpolar dibanding fase geraknya, yaitu berupa kolom oktadesilsilan (C18).
Pada penelitian ini, fase gerak yang digunakan adalah campuran buffer fosfat pH 3,2 dan metanol dengan perbandingan 90:10 yang merupakan kondisi optimum. Zat aktif pada pulveres A memiliki kelarutan yang baik dalam metanol, sehingga metanol digunakan dalam campuran fase gerak.
Buffer fosfat dibuat hingga pH 3,2 dan memiliki fungsi dalam mempertahankan pH dengan cara mempertahankan kesetimbangan rasio konsentrasi asam dan konsentrasi garamnya. Penggunaan buffer fosfat pH 3,2 bertujuan untuk meminimalkan ionisasi sampel. Buffer fosfat dibuat dengan menggunakan potensiometer yang telah dikalibrasi dan selalu dibuat baru supaya tidak ditumbuhi mikroorganisme.
Kecepatan alir pada sistem KCKT elusi isokratik ini adalah 1,5 ml/menit. Elusi isokratik merupakan elusi yang memiliki komposisi fase gerak yang tetap selama analisis. Kecepatan alir sistem KCKT ini adalah kondisi optimum yang mampu menghasilkan waktu retensi lebih pendek dengan adanya tekanan yang lebih besar pada kolom. Kondisi ini penting dalam efisiensi waktu kerja saat analisis.
Parasetamol dan fenobarbital memiliki gugus kromofor yang bertanggung jawab mengserapan radiasi ultraviolet. Ikatan rangkap pada gugus kromofor senyawa tersebut mengandung elektron π yang akan mudah tereksitasi ke tingkat yang lebih tinggi yaitu orbital π* apabila dikenai sinar radiasi elektromagnetik. Selain itu, terdapat pula gugus auksokrom pada parasetamol yang dapat meningkatkan intensitas serapan senyawa tersebut. Pada gambar berikut dapat dilihat gugus kromofor dan auksokrom masing-masing senyawa.
(a) (b)
Gambar 12. Gugus kromofor dan auksokrom (a) parasetamol dan (b) fenobarbital
Keterangan : Gugus kromofor =
Pada penelitian, didapatkan spektrum tum ang tindih parasetamol dan fenobarbital pada daerah ultraviolet yang tampak pada gambar berikut.
p
Gambar 13. Spektrum serapan tumpang tindih
Keterangan 09mg/ml
Pada gambar di atas, panjang gelombang serapan maksimum spektrum parasetamol adalah 245 nm. Menurut Widdop (1986), parasetamol dalam larutan asam memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 245 nm. Dengan demikian pada penelitian ini, panjang gelombang serapan maksimum parasetamol sesuai dengan teoritis.
Panjang gelombang serapan maksimum spektrum fenobarbital pada gambar di atas adalah 236 nm. Panjang gelombang 236 nm dipilih sebagai panjang gelombang pengamatan. Tujuannya adalah supaya fenobarbital dapat terdeteksi karena serapan fenobarbital lebih kecil dibandingkan parasetamol. Pada gambar di atas, parasetamol dapat memberikan serapan pada panjang gelombang pengamatan 236 nm.
2. Pembuatan kurva baku parasetamol dan fenobarbital
Pemisahan parasetamol dan fenobarbital pada penelitian ini menggunakan senyawa yang bersifat lebih po
n fase diam ya
jenis kromatografi partisi fase terbalik. Hal ini mengakibatkan
lar akan terelusi lebih dahulu pada fase gerak yang bersifat polar, sedangkan senyawal yang cenderung nonpolar akan lebih lama tertambat pada fase diam yang bersifat nonpolar, dan waktu retensinya akan lebih besar (Willard dkk, 1988).
Perbedaan waktu retensi tiap senyawa dipengaruhi oleh interaksi masing-masing senyawa dengan fase diam dan fase geraknya. Interaksi senyawa denga
ng bersifat nonpolar (C18) terjadi pada bagian senyawa yang non polar. Bagian senyawa yang non polar dan dapat berinteraksi dengan fase diam pada penelitian ini tampak pada gambar berikut.
Gambar 14. Gugus non polar pada parasetamol (A) dan fenobarbital (B) yang berinteraksi dengan fase diam
Gamb lebih banyak
gugus non polar darip bkan fenobarbital akan lebih
lama tertambat pada fase diam dan waktu retensinya akan semakin panjang.
Perbandingan parasetamol dan fenobarbital dalam sampel cukup besar yaitu 11,11 banding 1, dengan konsentrasi parasetamol 16,67 mg/ml dan konsentrasi fenobarbital 1,5 mg/ml. Adanya perbedaan konsentrasi kedua senyawa yang sangat besar, maka parasetamol dan fenobarbital pada penelitian ini tidak dapat diamati kromatogramnya secara bersamaan.
Permasalahan tersebut diatasi dengan menginjeksikan larutan campuran baku tanpa pengenceran ke dalam kolom terlebih dahulu untuk mengamati kromatogram fenobarbital dengan attenuasi 7 dan kemudian didapatkan kromatogram untuk fenobarbital. Pada parasetamol, dilakukan pengenceran sebanyak 80 kali terhadap larutan campuran baku yang sama. Larutan tersebut diinjeksikan ke dalam kolom dengan attenuasi 9. Kromatogram fenobarbital dan parasetamol pada kondisi KCKT yang optimum tampak pada gambar berikut.
ar di atas menunjukkan bahwa fenobarbital memiliki ada parasetamol. Hal ini menyeba
Gambar 15. Hasil kromatogram campuran baku parasetamol (a) dan fenobarbital (b) tanpa pengenceran
Gambar 16. Hasil kromatogram campuran baku parasetamol (a) dan fenobarbital dengan pengenceran 80 kali
Berdasarkan gambar di atas, fenobarbital terelusi dengan waktu retensi 8,583 menit dan lebih lama dibandingkan parasetamol yang memiliki waktu retensi 3,079
menit. Hal ini sesuai dengan teoritis di atas yang menyatakan bahwa senyawa fenobarbital yang bersifat nonpolar akan cenderung lebih lama tertambat pada fase diam, dan parasetamol yang cenderung polar akan lebih dahulu terelusi dengan adanya fase gerak campuran buffer fosfat dan metanol yang bersifat polar.
Penentuan kurva baku pada masing-masing senyawa dilakukan 3 kali replikasi. Persamaan kurva baku yang dibuat menyatakan hubungan linier antara konsentrasi dan luas area di bawah kurva (AUC) yang dihasilkan. Koefisien korelasi (r) digunakan sebagai parameter linieritasnya, yang menunjukkan korelasi antara konsentrasi dan AUC. Data kurva baku yang akan digunakan dipilih dari 3 replikasi dengan berdasarkan pada nilai r yang digunakan. Apabila menggunakan lima data dengan derajat bebas 3 taraf kepercayaan 95%, nilai r yang akan digunakan lebih besar daripada nilai r tabel yaitu sebesar 0,878. Persamaan kurva baku dari parasetamol dan fenobarbital dapat dilihat pada tabel berikut.
Tabel III . Hasil perhitungan kurva baku parasetamol
Replikasi I Replikasi II Replikasi III
C (mg/ml) AUC C (mg/ml) AUC C (mg/ml) AUC 0,0704 0,1408 0,2112 0,2816 0,3520 2104400 3945868 5711632 7613654 9308203 0,0701 0,1402 0,2104 0,2805 0,3506 2000887 3787538 5610533 7495138 8583764 0,0704 0,1408 0,2111 0,2815 0,3519 1928215 3708519 5286410 7387241 9252065 A B r 314133,8 25675272,73 0,9998 A B r 434227,73 24060393,01 0,99638 A B r 13735,68 26043167,19 0,9990 Keterangan = merupakan data kurva baku yang digunakan
Pada hasil perhitungan di atas, dapat dilihat bahwa nilai r yang diperoleh memiliki nilai yang lebih besar daripada nilai r tabel (0,878) dengan derajat bebas 3 dan taraf kepercayaan 95%. Dari data kurva baku parasetamol dapat dilihat pada replikasi pertama menunjukkan nilai r yang terbaik (korelasi linier) sehingga persamaan tersebut digunakan untuk menghitung konsentrasi parasetamol pada uji keseragaman kandungan. Persamaan kurva baku parasetamol yang diperoleh adalah Y = 25675272,73 X + 314133,8 dan selanjutnya akan digunakan dalam perhitungan keseragaman kandungan parasetamol.
Tabel IV . Hasil perhitungan kurva baku fenobarbital
Replikasi I Replikasi II Replikasi III C (mg/ml) AUC C (mg/ml) AUC C (mg/ml) AUC 0,931 1,133 1,376 1,619 2,023 2915335 3123870 3837280 4636561 5981528 0,926 1,127 1,368 1,610 2,012 2554248 3372032 4211253 4892742 6047231 0,929 1,131 1,373 1,615 2,019 2948199 3597697 3961215 4905167 6166657 A B r -189210,07 2907254,88 0,991 A B r -256467,77 3174761,44 0,997 A B r 175188,16 2929530,81 0,993 Keterangan = merupakan data kurva baku yang digunakan
Dari data kurva baku fenobarbital dapat dilihat pada replikasi kedua menunjukkan nilai r yang terbaik dan nilai SE yang terkecil sehingga persamaan tersebut digunakan untuk menghitung fenobarbital. Persamaan kurva baku fenobarbital yang diperoleh adalah Y = 3174761,44 X – 256467,77 dan selanjutnya akan digunakan dalam perhitungan keseragaman kandungan fenobarbital.