DNA KHV yang digunakan sebagai sumber isolasi gen adalah DNA yang berasal dari virus tipe liar. DNA ini diperoleh dari Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar (BRPBAT Bogor). Sampel DNA dari virus tipe liar tersebut berkode 2, 3, 1A, 2A, 3A, B1, B2, B3, U2B, U2C.
Plasmid yang digunakan adalah pGEMT-Easy (Promega) yang memiliki gen lacZ dan penanda resisten ampisilin, sedangkan plasmid yang berfungsi untuk mengekspresikan gen adalah pActD6 (Alimuddin et al. 2005) yang
mengandung promoter β-aktin (Act) dari ikan medaka (Jepang) yang menyisip pada situs EcoRI dan poly-A (terminator) yang yang berasal dari bovine growth hormone dan menyisip pada situs XhoI. Plasmid ini masih mengandung gen
masu salmon Δ6-desaturase- like di antara Act dan BGH-polyA. Disain Primer
Disain primer dilakukan terhadap ORF 25 sekuens lengkap koi herpesvirus (Aoki et al. 2007) yang dimulai pada basa ke-45587 sampai 47393. Primer forward disusun dari start codon ATG sampai basa ke-19, sedangkan primer reverse disusun dari stop codon TAA dan ditentukan basa komplemennya sampai sebanyak 22 basa. Untuk keperluan konstruksi sehingga hasil amplifikasi sesuai dengan situs yang ada di vektor ekspresi maka ke dalam primer forward disisipkan situs SalI.
Isolasi Gen Penyandi Glicoprotein
Isolasi DNA dilakukan dengan cara mengamplifikasi DNA KHV dengan menggunakan primer yang didisain khusus (primer spesifik) yaitu primer forward
F: TTGTCGACATGACGGGTTGTGGGGTTTG dan primer reverse R:
TTAGGGCCTCCGGGAAACCTGG. Kondisi reaksi polimerisasi adalah prakondisi pada suhu 95oC selama tujuh menit, denaturasi pada suhu 95oC selama 30 detik, annealing pada suhu 64oC selama 30 detik, ekstensi pada suhu 72 oC selama dua menit dan finally pada suhu 72oC selama tujuh menit.
Gen yang telah teramplifikasi tersebut kemudian dielektroforesis dan diisolasi dengan menggunakan EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit (Biobasic). Gen yang telah dielektroforesis tersebut kemudian dipotong dengan
25
menggunakan skalpel dan hasil potongan dimasukkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml. Larutan binding buffer sebanyak 400 ul ditambahkan ke dalam tabung mikro yang berisi potongan DNA dalam agar, diinkubasi pada suhu 55oC selama 10 menit dan selanjutnya dikocok dengan kuat sampai agar terlarut.
Isi tabung mikro dituang ke dalam EZ-10 column dan dibiarkan selama dua menit, selanjutnya disentrifugasi pada 10000 rpm selama dua menit dan supernatan dibuang. Cairan pencuci (wash solution) ditambahkan ke dalam column sebanyak 500 ul, disentrifugasi pada 10000 rpm selama satu menit. Cairan dalam tabung dibuang. Cairan pencuci (wash solution) ditambahkan lagi ke dalam column sebanyak 500 ul dan disentrifugasi pada 10000 rpm selama satu menit. Column ditempatkan pada tabung Eppendorf, ditambahkan sebanyak 30-50 ul elution buffer pada bagian tengah column dan diinkubasi pada suhu ruang selama dua menit. Column dan tabung eppendorf tersebut disentrifugasi pada 10000 rpm selama dua menit untuk mengelusi DNA.
Ligasi Fragmen Glikoprotein dan pGEMT-Easy
Gen penyandi glicoprotein pada KHV diligasikan dengan plasmid pGEMT-Easy (Promega) dengan cara mencampurkan antara 1 ul pGEMT-Easy dengan 4 ul gen glicoprotein KHV. Enzim ligase yang digunakan untuk proses ligasi tersebut adalah enzim T4 DNA ligase sebanyak 1 ul dan buffer T4 DNA ligase sebanyak 7 ul. Pencampuran dilakukan pada suhu ruang, dibiarkan selama 2 jam, setelah itu disimpan di refrigerator.
Transformasi pada E.coli Kompeten
Setelah plasmid pGEMT-Easy tersisipi gen glicoprotein KHV maka plasmid ini siap diintroduksi ke dalam sel kompeten yang berasal dari bakteri E.coli DH5α. Plasmid ini dispindown sebentar, sebanyak 6 ul plasmid dimasukkan ke dalam tabung mikro dan dikondisikan dingin (tabung diletakkan di es). Sebanyak 50 ul sel kompeten diambil secara hati-hati dan dimasukkan ke dalam tabung mikro yang berisi plasmid hasil ligasi. Tabung mikro ini diletakkan di dalam es sampai dalam suasana dingin selama 20 menit. Tabung selanjutnya diberi kejutan panas (heat shock) selama 50 detik pada waterbath yang bersuhu 42 oC. Tabung mikro segera dipindahkan ke dalam es selama dua menit dan segera diberi media SOC sebanyak 950 ul. Tabung diinkubasi dalam shaker incubator selama 1,5 jam pada suhu 37oC dengan kecepatan 200 rpm. Bakteri yang telah diinkubasi selanjutnya dibiakkan sebanyak 300 ul di
26
media Luria Bertani yang diberi ampisilin ( 100 ug/ml atau 20 ul/cawan), IPTG (20 mg/ml) sebanyak 100 ul/cawan dan X-gal (40 mg/ml) sebanyak 100 ul/cawan. Cawan diinkubasi overnight selama 16-24 jam pada 37 oC.
Verifikasi Hasil Transformasi
Verifikasi terhadap hasil transformasi dilakukan dengan cara mengamati adanya koloni putih-biru. Plasmid pGEMT-Easy yang digunakan memang mamiliki penanda khusus koloni putih-biru ini. Koloni putih adalah koloni yang tersisipi plasmid yang mengandung sisipan gen glikoprotein. Plasmid pGEMT- Easy ini memiliki gen lacZ yang menyandi β-galactosidasse yang akan mengubah molekul X-gal dari tidak berwarna menjadi melekul yang berwarna biru. Ekspresi gen lacZ diinduksi oleh IPTG (isopropil thiogalactosida). Bila gen lacZ tersisipi oleh molekul DNA lain, maka lacZ ini tidak dapat diekspresikan, sehingga sel yang mengandung plasmid demikian tidak dapat mengubah X-gal menjadi berwarna biru. Oleh karena itu sel yang tersisipi plasmid yang mengandung gen target maka koloninya akan berwarna putih. Sedangkan koloni biru berarti sel bakteri tersebut mengandung plasmid pGEMT-Easy yang tidak mengandung sisipan gen pada daerah lacZ.
Koloni yang berwarna putih ini diambil dengan tusuk gigi steril dan dimasukkan ke dalam tabung mikro. Sisa bakteri yang menempel di ujung tusuk gigi digores di agar untuk membuat master-plate. Untuk melihat adanya plasmid yang mengandung gen glikoprotein maka sel bakteri dipecah dengan menggunakan metode Cracking dengan menggunakan bahan-bahan kimia. Ke dalam tabung mikro yang berisi bakteri ditambahkan 5 µl buffer cracking (0.2
gram sakarosa, 40 µl NaOH 5 M dan 50 µl SDS 10 %; dilarutkan dalam 1 ml
akuades bebas ion) dan 5 µl EDTA dan dibiarkan selama 5 menit dalam suhu
ruang. Loading dye sebyak 1 µl ditambahkan pada cekungan tutup bagian
dalam. Ependof dispindown, divorteks skala medium dan disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 5 µl sampel dielektroforesis dan sisanya diencerkan 10 kali dan diverifikasi dengan PCR. Verifikasi dapat dilanjutkan dengan sekuensing apabila kedua verifikasi sebelumnya menunjukkan hasil yang positif.
27
Isolasi Plasmid
Bakteri yang mengandung pGEMT-GP diperbanyak untuk diambil plasmidnya sehingga sekuensing dapat dilakukan. Koloni putih yang mengandung plasmid pGEMT-GP dikultur pada media cair 2YT (1,6% polypeptone, 1% yeast extract, 0,5% NaCl dan 1,5% agarosa dalam SDW)pada suhu 37 oC selama 14-18 jam. Bakteri dipanen dan plasmidnya diisolasi.
Isolasi plasmid dilakukan menggunakan kit GeneJET Plasmid Miniprep (Fermentas Life sciences) dengan prosedur sesuai manual (Lampiran 2). Bakteri dari setiap tabung kultur dituang ke dalam tabung mikro 1,5 mL. Bakteri diendapkan dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm sekitar 30 detik, supernatan dibuang dan ini dilakukan sampai bakteri di media kultur habis. Ke dalam tabung mikro berisi pelet bakteri ditambahkan Resuspend Solution sebanyak 250 µL, dilanjutkan dengan vorteks hingga semua pelet bakteri lepas dari dasar tabung. Kemudian ditambahkan Lysis Solution sebanyak 250 µL, tabung mikro dibolak-balik sekitar 4-6 kali sampai larutan menjadi bening/jernih (tidak perlu dilakukan vorteks pada tahap ini untuk menghindari kerusakan DNA serta tidak disimpan lebih dari 5 menit untuk mencegah denaturasi plasmid DNA yang berbentuk supercoil). Setelah itu ditambahkan Neutralization Solution sebanyak 350 µL. Tabung mikro dibolak-balik dengan kuat kira-kira 4-6 kali, dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke spin column yang disediakan satu paket dengan kit yang digunakan dengan cara menuang maupun diambil dengan menggunakan pipet, dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama satu menit. Cairan yang tersaring dibuang dan column ditempatkan kembali pada tabung koleksi pasangannya. Sebanyak 500 µLWash Solution dimasukkan ke dalam GeneJet spin column, disentrifugasi selama 30-60 detik pada kecepatan 13.000 rpm. Column dikembalikan ke tabung koleksi semula. Penambahan Wash Solution dilakukan sekali lagi dan disentrifugasi dengan kecepatan dan waktu yang sama. Larutan yang tersaring dibuang, column ditempatkan kembali pada tabung koleksi, dilakukan sentrifugasi pada 13.000 rpm selama satu menit untuk menghindari terdapatnya residu etanol pada plasmid. Plasmid DNA dilarutkan menggunakan SDW sebanyak 30-50 µL, divorteks dan tabung mikro berisi plasmid dibiarkan selama 2 menit di suhu ruang. Sentrifugasi dilakukan pada suhu ruang dengan kecepatan 13.000 rpm selama 2 menit. Supernatan yang berisi plasmid DNA dipindahkan ke tabung mikro yang baru. Konsentrasi
28
DNA diukur menggunakan mesin kuantifikasi DNA/RNA merek Gene Quant. Plasmid pGEMT-Easy yang sudah mengandung gen glikoprotein selanjutnya dikirim ke Laboratorium Fish Physiology, Tokyo University of Marine Science and Technology untuk disekuensing. Hasil sekuensing ini kemudian dianalisis dengan software Genetix Version 7 dan Blast 2.0 (www.ebi.ac.uk) untuk disejajarkan (alignment) dengan data yang ada di GeneBank.
Pembuatan Konstruksi Vaksin DNA
Vektor dasar plasmid yang dibangun untuk membawa gen glikoprotein adalah pGEMT-Easy (Promega), yaitu plasmid berspektrum inang luas dengan penanda resisten ampisilin. Gen glikoprotein yang diligasikan dengan pGEMT- Easy dan telah diperbanyak dipotong (didigesti) dengan menggunakan enzim SalI. Gen ini selanjutnya disisipkan pada plasmid pActD6 (Alimuddin et.al. 2005). Plasmid dasar yang digunakan tersebut berasal dari plasmid p-Bluescript (Lampiran 4). Plasmid pActD6 ini mengandung promoter β-actin (Act) dari ikan medaka asal Jepang, gen salmon masu Δ6-desaturase-like dan polyA dari bovine growth hormone. Gen masu salmon Δ6-desaturase-like ini dikeluarkan dengan menggunakan enzim SalI dan posisinya digantikan dengan gen glikoprotein sehingga terbentuk konstruksi pActGP25 yang siap diekspresikan di ikan (Lampiran 2).
Gen GP25 inilah yang diharapkan dapat menyandi terbentuknya glikoprotein yang berperan menginduksi sistem kekebalan tubuh ikan sehingga ikan mampu membentuk antibodi yang dapat menetralkan virus KHV. Plasmid yang telah dikonstruksi sedemikian rupa ini selanjutnya digunakan sebagai vaksin DNA. Verifikasi ligasi gen GP25 pada pAct dengan arah yang benar dilakukan menggunakan metode PCR dengan primer F-GP dan R-T7 (5’- TTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAA-3’). Koloni bakteri yang membawa plasmid pAct-GP25 dengan arah ligasi yang benar dikultur dan selanjutnya plasmid pAct-GP25 diisolasi menggunakan kit GeneJET Plasmid Miniprep (Fermentas Life Sciences, USA).
