BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
3.3. Cara Kerja
3.3.4. Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri Patogen
Bakteri patogen yang digunakan adalah Bacillus subtillis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus. Bakteri tersebut masing-masing diinokulasikan satu ose ke dalam medium NA miring, kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 370C.
3.3.4.2. Perhitungan Bakteri Patogen Dengan Spektrofotometer
Satu ose bakteri patogen yang sudah diremajakan, diinokulasi ke dalam 100 ml media NB. Medium yang berisi bakteri patogen tersebut diinkubasi dalam shaking incubator (150 rpm, suhu 280C). Setiap 2 jam, 1 ml kultur bakteri patogen tersebut diambil dan diencerkan dengan 1 ml air steril dalam tabung reaksi. Pengenceran ini dilakukan secara berseri dari pengenceran 1/2 hingga pengenceran 1/32 menggunakan 1 ml sampel dan 1 ml air steril sebagai diluent. Setiap pengenceran diambil 2 ml dan dimasukkan ke dalam kuvet. Tiap pengenceran ini diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 620 nm. Dari hasil pengukuran tersebut dibuat kurva pertumbuhan bakteri patogen.
3.3.5. Uji Aktivitas (Bioassay) Antibakteri
Bakteri yang digunakan dalam uji bioaktivitas ini adalah Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Pseudomonas aeruginosa. Langkah-langkah yang dilakukan dalam uji ini adalah :
1. Pembuatan Kultur Bakteri Uji
Bakteri-bakteri uji diinokulasikan ke dalam 60 ml media NB masing-masing sebanyak satu ose. Media tersebut diinkubasi dengan shaking incubator (150 rpm, suhu 280C) selama 15 jam untuk Bacillus subtillis, 7 jam untuk Escherichia coli, 9 jam Pseudomonas aeruginosa dan 11 jam untuk Staphylococcus aureus.
2. Pengujian
Setiap bakteri uji (Bacillus subtillis sebanyak 900 µl, Eschericia coli sebanyak 100 µl, Pseudomonas aeruginosa sebanyak 150 µl dan Staphylococcus aureus sebanyak 200 µl) ditambahkan ke dalam media NA steril (suhu 500C), sehingga kerapatan bakteri dalam media sebanyak ± 1 x 106 CFU/ml. Cara perhitungan koloni dapat dilihat pada lampiran 6. Media yang telah ditambahkan bakteri uji tersebut dikocok supaya merata, kemudian dituang ke dalam petri persegi panjang dan dibiarkan memadat.
Larutan ekstrak dengan konsentrasi 10 µg/ml dan 20 µg/ml masing-masing diteteskan ke permukaan paper disc sebanyak 15 µl (mengandung ekstrak
sampel 150 µg sampai 300 µg). Penetesan tersebut dilakukan sebanyak tiga kali (masing-masing 5 µl). Paper disc yang telah ditetesi ekstrak, dikeringkan di atas plat kaca. Setelah kering, paper disc tersebut diletakkan di atas media NA padat berisi bakteri uji. Paper disc kontrol positif (ampisilin, penisilin, streptomisin, amoksisilin dan tetrasiklin) dan kontrol negatif (metanol dan etil asetat) masing-masing juga diletakkan pada media NA padat berisi bakteri uji. Inkubasi dilakukan pada suhu 370C selama 48 jam. Setelah inkubasi, zona hambat yang terbentuk diukur diameternya dengan jangka sorong.
3.3.6. Uji Aktivitas (Bioassay) Antikhamir 1. Pembuatan Kultur Candida albicans
Candida albicans diinokulasikan ke dalam 20 ml media PDB sebanyak satu ose. Media tersebut diinkubasi dengan shaking incubator (150 rpm, suhu 280C) selama 3 hari.
2. Pengujian
Candida albicans sebanyak 400 µl ditambahkan ke dalam media PDA steril (500C), sehingga kerapatan Candida albicans dalam media sebanyak ± 1 x 106 CFU/ml. Cara perhitungan koloni dapat dilihat pada lampiran 6. Media yang telah ditambahkan khamir uji tersebut dikocok supaya merata, kemudian dituang ke dalam petri persegi panjang dan dibiarkan memadat.
Larutan ekstrak dengan konsentrasi 10 µg/ml dan 20 µg/ml masing-masing diteteskan ke permukaan paper disc sebanyak 15 µl (mengandung ekstrak sampel 150 µg sampai 300 µg). Penetesan tersebut dilakukan sebanyak tiga
kali (masing-masing 5 µl). Paper disc yang telah ditetesi ekstrak, dikeringkan di atas plat kaca. Setelah kering, paper disc tersebut diletakkan di atas media PDA padat berisi khamir uji. Paper disc kontrol positif (nystatin) dan kontrol negatif (metanol dan etil asetat) masing-masing juga diletakkan pada media PDA padat berisi khamir uji. Inkubasi dilakukan pada suhu 280C selama 24-48 jam. Setelah inkubasi, zona hambat yang terbentuk diukur diameternya dengan jangka sorong.
3.3.7. Uji Aktivitas (Bioassay) Antifungi
1. Pengenceran dan Perhitungan Spora Aspergillus niger
Larutan tween sebanyak 3 ml disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 1210C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Larutan tween steril dipipet sebanyak 1 ml ke dalam kultur Aspergillus niger yang ditumbuhkan pada media PDA slant. Spora Aspergillus niger digores sampai terlepas dari agar menggunakan tip pipet. Spora tersebut diencerkan secara berseri sampai pengenceran 10-3 menggunakan 1 ml sampel dan 9 ml air steril sebagai diluent.
2. Pengujian
Aspergillus niger sebanyak 800 µl ditambahkan ke dalam media PDA (500C) sehingga kerapatan Aspergillus niger sesuai dalam media sebanyak ± 1 x 106 CFU/ml. Cara perhitungan koloni dapat dilihat pada lampiran 6. Media yang telah ditambahkan spora A. niger dikocok supaya merata, kemudian dituang ke dalam petri persegi panjang dan dibiarkan memadat.
Larutan ekstrak dengan konsentrasi 10 µg/ml dan 20 µg/ml masing-masing diteteskan ke permukaan paper disc sebanyak 15 µl (mengandung ekstrak sampel 150 µg sampai 300 µg). Penetesan tersebut dilakukan sebanyak tiga kali (masing-masing 5 µl). Paper disc yang telah ditetesi ekstrak, dikeringkan di atas plat kaca. Setelah kering, paper disc tersebut diletakkan di atas media PDA padat berisi fungi uji. Paper disc kontrol positif (nystatin) dan kontrol negatif (metanol dan etil asetat) masing-masing juga diletakkan pada media PDA padat berisi fungi uji. Inkubasi dilakukan pada suhu 280C selama 48 jam. Setelah inkubasi, zona hambat yang terbentuk diukur diameternya dengan jangka sorong.
3.3.8. Perhitungan Jumlah Sel Mikroba Patogen
3.3.8.1. Pengenceran dan Metode Total Plate Count (TPC)
Kultur bakteri dan khamir uji masing-masing dikocok dengan vortex mixer. Kultur yang telah dikocok tersebut, diambil 1 ml dan dituang ke dalam 9 ml air steril. Kultur diencerken secara berseri dari pengenceran 10-1 sampai pengenceran 10-8. Hasil pengenceran 10-5 sampai 10-8 ditumbuhkan pada media NA plate untuk bakteri dan PDA plate untuk khamir, dan setiap pengenceran dilakukan secara duplo. Bakteri dan khamir dituang ke dalam media NA dan PDA secara pour plate, setelah itu diinkubasi dalam inkubator (pada suhu 370C selama
24 jam untuk bakteri dan 280C selama 24-48 jam untuk khamir) (Fardiaz, 1993). Penghitungan jumlah koloni yang terbentuk hanya pada rentang 25 sampai 250 koloni. Kerapatan koloni dihitung dengan rumus :
CFU/ml = Jumlah koloni
Volume mikroba yang ditumbuhkan x pengenceran
Setelah diketahui kerapatan koloni dalam 1 ml media, maka dilakukan perhitungan untuk mengetahui jumlah mikroba yang akan ditambahkan ke dalam media uji. Rumusnya adalah :
CFU/ml media = jumlah mikroba yang diperoleh × faktor pengenceran volume media
3.3.8.2. Metode Direct Cell Number Count
Jumlah sel Aspergillus niger dihitung dengan metode Direct Cell Number Count menggunakan haemocytometer. Satu tetes spora A. niger diteteskan pada haemocytometer kemudian haemocytometer ditutup dengan cover glass. Haemacytometer tersebut diletakkan di atas mikroskop dan diamati pada perbesaran 200 kali. Jumlah spora A. niger dihitung secara acak hanya pada 10 kotak dari 25 kotak berukuran sedang yang ada dalam hemacytometer. Hasil perhitungan dijumlahkan dan dimasukkan dalam rumus :
Spora/Unit = Jumlah spora x faktor koreksi penggunaan kotak sampel x haemocytometer grid x faktor pengenceran
Jumlah spora yang dituang ke dalam media uji dihitung menggunakan rumus : Spora/ml media = jumlah spora/unit x faktor pengenceran
Volume media