EFEK SITOGENETIK PADA PEKERJA RADIASI
II.3. Pembuatan preparat dan pengecatan kromosom dengan teknik FISH (2 -3
probe)
Endapan sel limfosit diteteskan di atas gelas preparat pada 1-2 tempat yang berbeda, dibawah mikroskop, dilakukan seleksi terhadap preparat yang mempunyai sebaran kromosom yang baik pada sel tahap metafase dan dikeringkan di atas hot plate 65º C selama 1½ jam.. Preparat tersebut didehidrasi dengan dimasukkan ke dalam seri
coplin jar yang berisi etanol 70% sebanyak 2x masing-masing selama 2 menit, etanol 90% 2x selama 2 menit dan etanol 100% sebanyak 1x selama 5 menit. Kromosom pada preparat selanjutnya di denaturasi dengan dimasukkan ke dalam larutan formamida dan diinkubasi pada waterbarh 65ºC selama 1½ menit. Preparat dicuci secara berturutan dengan alkohol bertingkat 70% dingin selama
4 menit, 70% selama 2 menit, 90% sebanyak 2 x masing-masing selama 2 menit dan 100% selama 5 menit. Kromosom pada preparat telah siap untuk dilakukan hibridisasi dengan campuran whole chromosome probe (WCP) dengan fluorochrom Fluorescent isothiocyanate (FITC) nomor 1, 2, 5, 6 dan 10 WCP dengan fluorochrome texas red no 1 dan 5 yang digunakan merupakan produksi
ID Labs. USA.
Dibuat campuran masing-masing 2 µl WPC berlabel Fluorescent isothiocyanate
(FITC) dan 2 µl WPC texas red dengan 6 µl
buffer, disentrifus selama 1-3 detik, didenaturasi pada suhu 65º C selama 10 menit, dan kemudian diinkubasi pada
waterbath 37 ºC selama 45 menit. Proses hibridisasi (pengecatan) dilakukan dengan meneteskan larutan probe pada preparat yang telah di denaturasi, kemudian ditutup dengan
coverslip dan dilem untuk mencegah terjadi penguapan. Preparat diletakkan dalam wadah plastik dan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 16 jam. Setelah proses hibridisasi
coverslip dibuka, selanjutnya dilakukan tahap pencucian dengan cara berturutan preparat direndam dalam seri coplin jar yang berisi larutan pencuci stringency 45 ºC sebanyak 2x masing-masing selama 5 menit, larutan 1 x SSC sebanyak 2 x selama 5 menit, dan larutan detergen sebanyak 1x selama 4 menit. Pencucian dilakukan kembali untuk WCP dengan fluorochrome texas red dengan melakukan inkubasi preparat dengan reagen campuran biotinylated Anti Avidin pada
larutan pencuci detergen, diteteskan 10 µl 4,6
diamidino-2-phenylindole (DAPI), ditutup, dan didiamkan selama 10 menit. DAPI yang merupakan counterstain terhadap kromosom yang tidak dihibridisasi dengan WCP, diperoleh dari VYSIS (VX-32804830). Preparat segera diamati dengan mikroskop
epi-fluorescent yang dilengkapi dengan dual filter, dan dilakukan pemotretan terhadap kromosom yang memiliki pendaran probe
kromosom.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Pemeriksaan aberasi kromosom telah digunakan sebagai biomonitoring pada pekerja radiasi yang telah terpapar radiasi pengion sebagai konsekwensi pekerjaan. Dalam penelitian ini sampel darah limfosit diperoleh dari 45 pekerja radiasi dan 5 non pekerja radiasi. Untuk pekerja radiasi yang telah diambil sampel darahnya mempunyai masa kerja bervariasi yaitu 2-36 th, dan dikelompokkan menjadi 4 kelompok, pekerja dengan masing-masing kisaran masa kerja 1 ? 10 tahun (A), masa kerja 11- 20 tahun (B), masa kerja 21-30 tahun (C), masa kerja >31 tahun (D) dan (E) adalah kelompok pekerja kontrol. Penerimaan dosis berdasarkan data rata-rata film badge dan atau TLD untuk 3-5 tahun terakhir berkisar berkisar < 50 mSv/tahun.
Pemeriksaan terhadap aberasi kromosom dilakukan untuk jenis aberasi kromosom tak stabil yaitu disentrik, fragmen dan cincin, menggunakan pewarna giemsa. Hasil pengamatan kromosom tak stabil (disentrik) pada 45 sampel darah yang masing-masing diamati untuk setiap 500 atau 1000 sel metafase dikelompokan berdasarkan kisaran masa kerja ditampilkan pada Grafik 1. Pada kelompok pekerja radiasi A yang telah diamati aberasi kromosomnya telah ditemukan 1 pekerja radiasi dengan masa kerja 7 tahun dengan jumlah aberasi kromosom tak stabil 0,1 disentrik per sel yang dilengkapi dengan 3 fragmen. Pada kelompok B hanya ditemukan 14 fragmen dari 7 orang pekerja dengan kisaran jumlah fragmen bervariasi 1 ? 4 fragmen. Sedangkan untuk kelompok C telah ditemukan aberasi kromosom pada 3 pekerja yaitu masing-masing dengan masa kerja 23 tahun dengan 1 disentrik, pada masa kerja 24 tahun dengan 1 ring dan 2 fragmen, dan pada masa kerja 26 tahun, dengan 1 disentrik, 1 ring dan 6 fragmen. Namun untuk semua jenis aberasi kromosom tersebut masih dikategorikan dalam kisaran normal, karena mengacu pada IAEA bahwa frekuensi latar untuk kedua jenis aberasi tersebut berturut-turut 1-3 disentrik dan 4-7 fragmen masing-masing dalam setiap 1000 sel metafase masih dikategorikan normal [ 11,14 ].
Gambar 3. Jumlah aberasi kromosom pada kelompok pekerja radiasi yang diamati dengan pewarnaan Giemsa
Gambar 4 . Visualisasi sel metafase dengan kromosom disentrik pada pekerja radiasi dengan masa kerja 7 tahun.
Gambar 5. Visualisasi sel metafase dengan kromosom disentrik pada pekerja radiasi dengan masa kerja 23 tahun.
Gambar 6. Visualisasi sel metafase dengan kromosom ring pada pekerja radiasi dengan masa kerja 24 tahun.
Gambar 7. Sebaran kromosom pada tingkat metafase. Sel metafase dengan kromosom disentrik dan fragmen pada pekerja radiasi dengan masa kerja 26 tahun.
1 2 0 3 14 15 2 0 2 0 0 5 10 15 20 A B C D E M a s a k e rj a Aberasi kromosom Disentrik Fragmen Cincin
Frekuensi dari kromosom disentrik telah dianggap sebagai indikator sensitif terhadap paparan radiasi pengion dan telah diaplikasikan untuk biomonitoring dan dosimeter biologi [12]. Namun demikian kromosom disentrik merupakan kromosom tak stbil karena frekuensi disentrik akan tereliminasi sejalan dengan umur dari limfosit. Rata rata half life untuk kromosom disentrik adalah 130 hari [12,13]. Pada kasus pajanan kronik yang diterima pekerja dengan penerimaan dosis rendah pada laju dosis rendah kemungkinan aberasi kromosom yang diinduksi pada limfosit adalah hanya pada populasi limfosit yang mempunyai umur panjang (long life population) [14].
Pada penelitian ini pemeriksaan kromosom stabil dengan teknik FISH
painting, dilakukan pada sampel pekerja radiasi dengan masa kerja >20 tahun dan untuk masa kerja < 5 tahun untuk mengkaji dosis radiasi akibat pajanan kronik (akumulasi dosis yang diterima) terhadap kondisi kromosomnya. Visualisasi keberadaan aberasi kromosom translokasi dilakukan dengan menggunakan teknik pengecatan kromosom (chromosome painting technique) yang disebut Fluorescence in situ hybridization (FISH) dengan komposisi nomor probe kromosom nomor 2,6,10 yang dilabel hanya fluorochrom FITC atau sering disebut pewarna tunggal yang ditunjukkan dengan warna berpendar pada kromosom target (Gambar 8).
Gambar 8. Pewarnaan kromosom dengan teknik FISH pewarna tunggal FITC menggunakan probe kromosom nomor 2, 6, 10. Pengecatan kromosom juga dilakukan dengan komposisi probe kromosom kromosom no 2, 5, 10 menggunakan campuran fluorochrome texas red dan FITC atau sering disebut pewarna ganda ditunjukkan pada gambar 9. Dengan pengecatan ganda menggunakan warna berbeda ini akan lebih memudahkan dalam menganalisa adanya kerusakan kromosom translokasi.
Gambar 9. Pewarnaan kromosom dengan teknik FISH pewarna ganda FITC dan Texas red menggunakan probe kromosom nomor 2, 5, 10. 2 5 10
6
2 10
Pengecatan kromosom yang sama juga dilakukan pada komposisi kromosom nomor 1,2,5 ditunjukkan pada Gambar 10. Namun dari hasil pengecatan yang telah dilakukan hasil pengamatan kromosom stabil untuk pekerja radiasi dengan masa kerja > 20 maupun untuk pekerja radiasi dengan masa kerja < 5 tahun yang diamati pada sel limfosit tidak ditemukan adanya aberasi kromosom translokasi.
Gambar 10. Pewarnaan kromosom dengan teknik FISH pewarna ganda FITC dan Texas red menggunakan probe kromosom nomor 1, 2, 5.
Tehnik FISH ini di dasarkan pada hybridisasi pada molekul DNA pendek yang probenya dilengkapi dengan complementari sequence pada genom. Probe selanjutnya dilabel dengan fluorescent dye yang akan menunjukkan warna pendar pada fragmen kromosom yang mengalami translokasi. Penggunakan probe dengan urutan genom yang spesifik memungkinkan untuk memperoleh informasi sejumlah gambaran dan lokasi patahan kromosom. Dengan proses
hibridisasi yang simultan dengan probe yang dilabel dan penggunaan flurescent dye yang berbeda dapat mendeteksi beberapa translokasi yang berbeda pada genom secara bersamaan. Hal ini dapat memberikan informasi tentang sekuen amplifikasi, dilesi atau translokasi beserta lokasinya pada genom [14].
Tidak ditemukannya aberasi kromosom translokasi pada pekerja radiasi karena paparan radiasi yang diterima tidak cukup besar untuk menginduksi terbentuknya aberasi kromosom, atau translokasi terjadi pada kromosom yang tidak dilakukan proses painting. Dosis ambang radiasi secara akut yang dapat menginduksi aberasi kromosom translokasi adalah sekitar 0,25 Gy atau sebagai efek deterministik [7], sedangkan frekuensi latar akibat radiasi untuk aberasi kromosom stabil translokasi adalah 5-/1000 sel, dan waktu paro translokasi berkisar 3- 11 tahun akibat radiasi secara parsial pada tubuh dengan dosis tinggi [15, 16].
IV. KESIMPULAN
Pendeteksian adanya aberasi kromosom dalam sel limfosit yang diketahui sebagai biomarker yang spesifik hanya terinduksi oleh paparan radiasi pengion. Terhadap pekerja radiasi yang diperkirakan menerima paparan radiasi berlebih, dapat dilakukan suatu tindakan sebagai konfirmasi terhadap data dosis radiasi yang diperoleh
1
5
2
dari dosimeter fisik. Pemantauan status kesehatan para pekerja radiasi berdasarkan pemeriksaan aberasi kromosom menunjukan aberasi kromosom disentrik yang ditemukan pada pekerja radiasi yaitu 0,001 % masih dalam batas normal. Sedangkan aberasi kromosom translokasi tidak ditemukan pada sampel darah pekerja radiasi.Kondisi tingkat kerusakan kromosom pada sel darah pekerja yang diinduksi oleh paparan radiasi akibat kerja masih dalam dalam batas normal. Hal ini menunjukkan bahwa sistem proteksi radiasi telah berjalan dengan baik. Hasil penerimaan dosis pekerja radiasi, diperoleh data besaran dosis akumulasi 0-18,47 mSv, dengan masa kerja maksimal 25 tahun. Dari hasil pengamatan kromosom tak stabil (disentrik) pada 30 pekerja radiasi diperoleh satu pekerja radiasi kelompok A dengan aberasi kromosom disentrik 0;001/sel metafase, dan satu pekerja radiasi kelompok C dengan 0,002 kromosom disentrik/sel. Hasil tersebut masih dalam kisaran normal. Sedangkan untuk kromosom translokasi dengan pengecatan kromosom menggunakan teknik FISH dengan triple probe, tidak ditemukan pada ketiga kelompok pekerja radiasi. Dengan demikian dapat disimpulkan besaran dosis yang diterima pekerja masih dalam batas ambang yang diijinkan (<50 mSv/tahun) dan kondisi tingkat kerusakan kromosom pada sel darah pekerja yang diinduksi oleh paparan radiasi akibat kerja masih dalam batas normal.
V. DAFTAR PUSTAKA
1. INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY, Safety Series No. 102, Recommendations for the Safe Use and Regulation of Radiation Sources in Industry, Medicine, Research, and Teaching, IAEA, Vienna (1990).
2. INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY. Practical Radiation Safety Manual, Manual on Nuclear Gauge, IAEA, Vienna (1992).
3. BADAN PENGAWAS TENAGA NUKLIR, Penyuluhan Peraturan Perundangan Keselamatan Nuklir, Jakarta (2002).
4. TUBIANA, M., The report to the French Academy of Science, Problems associated with the effects of low dose of ionizing radiation, J. Radiation Protection, 1998, 18, 243-248
5. ALATAS, Z., Indikator biologik kerusakan tubuh akibat pajanan radiasi,
Cermin Dunia Kedokteran, 138, 41-45, 2003.
6. HALL., E.J RADIOBIOLOGY FOR THE RADIOBIOLOGIST JB
LIPPINCOTT COMPANY,
PHILADELPHIA.5 EDITION. 2000 7. IAEA Cytogenetic Dosimetry :
Application in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies IAEA Vienna 2011.
8. KONDO, S., Health Effects of Low Level Radiations. Kinki University Press, Osaka Japan and Medical Physics Publishing, Madison USA 1993
9. COCO-MARTIN, J.M., SMEET, M.F.M.A., POGGENSEE, M., MOOREN, E., HOFLAND, I., VAN DE BRUG, M., OTTENHEIM, C., BARTELINK, H. AND BEGG, A.C. USE
OF FLOURESCENCE IN SITU
HYBRIDIZATION TO MEASURE
CHROMOSOME ABERRATIONS AS A
PREDICTOR OF RADIOSENSITIVITY IN
HUMAN TUMOUR CELLS. INT. J.
10. NATARAJAN, AT, DARROUDI, F., BERG, M., et al. Biological dosimetric studies in the Goiania accident. IAEA-TECDOC-1131, Restoration of environments affected by residues from radiological accidents.Approaches to decision makingÓ 127-132, 2000.
11. NATARAJAN,AT, SANTOS, SJ, DARROUDI, F et al. 137 Cesium-induced chromosome aberrations analyzed by fluorescence in situ hybridization: eight years follow up of the Goiania radiation accident victims. Mutat Research 400: 299-312, 1998. {8}.
12. ZELJEZIC, D., and
GARAJVRHOVAC,V, Fluorescence In Situ Hibridisation in Detecting Chromosome Aberrations Caused By Occupational Exposure to Ionising Radiation, Institute for Medical Research and Occupational Health, Zagreb, Croatia, Arh Hig Rada Toksikol 2006,57.65-68.
13. STEPHAN, G., PRESSL, S, KOSHPESSOVA GULSYM,K and GUESUV I.B. Analysis of FISH Painted Chromosomes in Individual Living Near Semipalatinsk Nuclear Test Site. Radiation Research 155, 796-800 (2001). 14. GEORGE, K. WILLINGHAM, V., and
CUCINOTTA, F.A. Stability of Chromosome Aberrations in the Blood Lymphocytes of Astronauts Measured after Space Flight by FISH Chromosome Painting. Radiation Research 164,474-480, 2005.