DAFTAR PUSTAKA
2 TINJAUAN PUSTAKA
2.3 Pembuatan Preparat dengan Metode Parafin
Proses pembuatan preparat dengan metode parafin terdiri dari beberapa
tahap yaitu fiksasi, pencucian, dehidrasi, infiltrasi, embedding, pengirisan,
penempelan, pewarnaan, dan penutupan. Tahap fiksasi dilakukan agar jaringan
tidak membusuk dan untuk mempertahankan struktur jaringan.
Formalin-acetoalcohol digunakan sebagai bahan yang memberikan fiksasi sempurna yang dilanjutkan dengan pencucian dan dehidrasi. Proses pencucian dilakukan untuk
menghilangkan reagen yang masih ada pada obyek. Cairan yang digunakan dalam
proses pencucian ini tergantung pada reagen yang digunakan sebelumnya. Hampir
semua larutan pengencer terutama yang mengandung chromic acid dapat dicuci
dengan air, jika proses pencucian dengan air mengalir sulit dilakukan dapat dilakukan dengan air dalam jumlah besar dan dikerjakan berulang kali. Apabila air yang digunakan terlalu banyak mengandung udara, maka harus dilakukan proses
penguapan dengan pemanasan atau menggunakan suction pump. Proses pencucian
dengan menggunakan larutan jumlahnya harus sama dengan larutan fiksasi (Johansen 1940).
Tahap dehidrasi pada proses pembuatan preparat dengan metode parafin merupakan tahap pengambilan air dari jaringan. Jika pencucian dilakukan dengan air maka dehidrasi dilakukan dengan 5 % etanol pada air dan diteruskan dengan 11, 18, dan 30 % etanol kemudian direndam setiap dua jam pada masing-masing larutan. Jika pencucian dilakukan dengan alkohol diatas 70 % maka harus menggunakan xilol, kloroform, atau larutan essensial setelah proses dehidrasi pertama yang diikuti dengan alkohol absolut (Humason 1967).
Tahap dehidrasi selesai dilanjutkan dengan infiltrasi. Tahap ini merupakan proses transfer butil alkohol ke parafin. Bahan ditransfer untuk campuran yang sama pada minyak parafin dan tertier butil alkohol dilakukan selama 1 jam. Botol kecil diisi 3/4 cairan parowax dan didiamkan sampai cairan tersebut mulai mengeras namun jangan sampai membeku. Setelah obyek terendam campuran minyak parafin, parowax, dan alkohol diganti dengan cairan yang baru. Pergantian
cairan parafin yang baru dilakukan tiap 6 jam sekali sebanyak 3 kali (Johansen 1940).
Proses penanaman dikerjakan dengan memasukkan obyek dalam parafin cair ke dalam kotak/cetakan dan dibiarkan dalam air selama setengah jam sampai dingin. Jika pendinginan parafin terlalu lambat maka akan terbentuk kristal yang meyebabkan cetakan bercak putih dan tidak dapat dilakukan pengirisan. Proses penanaman selesai dan parafin telah dingin dan keras, akan dilakukan proses pengirisan yang merupakan pembuatan sayatan atau pita dari blok parafin yang telah terbentuk dengan menggunakan mikrotom. Setelah itu dilakukan proses penempelan pita yang telah dipotong ke dalam gelas obyek dan diberi beberapa tetes air (Humason 1967).
Tahap selanjutnya adalah pewarnaan yang merupakan proses pemberian warna pada gelas obyek. Proses ini dilakukan untuk memudahkan dalam melihat jaringan pada tumbuhan. Pewarnaan ini dapat menggunakan satu pewarna atau beberapa kombinasi warna disesuaikan dengan tujuan pengamatan. Sebagai contoh apabila pewarnaan ditujukan untuk melihat selulosa pada dinding sel maka dapat digunakan aniline blue, fast green CFC, light green, dan congo red. Untuk melihat protein dapat digunakan safranin, sedangkan lemak menggunakan sudan III dan lain-lain (Humason 1967). Sebelum pewarnaan ini dilakukan, parafin harus dihilangkan terlebih dahulu dari obyek. Untuk proses ini dapat digunakan xilol dan campuran xilol dengan etanol. Sebelum diberi pewarna gelas preparat dibilas terlebih dahulu dengan akuades kemudian dicelupkan ke dalam pewarna sesuai dengan tujuan pewarnaan. Setelah pencelupan dalam larutan pewarna selesai dilakukan dehidrasi dengan alkohol 35, 70, dan 95 % lalu ditutup dengan perekat
misalnya entelan (canada balsam) dan dilanjutkan dengan coverslip. Preparat
2.4Pati
Pati merupakan homopolimer glukosa dengan ikatan α-glikosidik. Pati terdapat pada tumbuhan tingkat tinggi sebagai granula semi kristalin dari bahan polimer. Dalam bentuk aslinya tepung pati merupakan butir-butir kecil yang disebut granula pati. Granula pati mempunyai bentuk dan ukuran yang berbeda-beda tergantung dari jenis patinya (Swinkle 1985). Granula pati tersusun atas tiga komponen utama yaitu amilosa, amilopektin dan bahan antara yang merupakan komponen minor berupa lemak dan protein.
Secara umum pati terdiri dari dua fraksi yang dapat dipisahkan dengan air panas di bawah suhu gelatinisasi. Fraksi terlarut disebut amilosa dan fraksi tidak
terlarut disebut amilopektin. Amilosa mempunyai struktur lurus dengan ikatan α
-(1,4)-D-glukosa sedangkan amilopektin terdiri dari struktur bercabang dengan ikatan α-(1,6)-D-glukosa sebanyak 4-5% berat total (Winarno 2008). Konsentrasi amilosa berpengaruh terhadap karakteristik gel yang terbentuk. Gel yang
mengandung banyak amilosa mempunyai karakteristik mekanik film yang
dihasilkan lebih baik dibandingkan dengan gel yang kaya akan amilopektin
(Leloup et al. 1991).
Pati dapat diekstrak dengan berbagai cara, berdasarkan bahan baku dan penggunaan dari pati itu sendiri. Pati dapat diproses dengan cara ekstraksi yang terdiri perendaman, disintegrasi, dan sentrifugasi. Perendaman dilakukan dalam larutan natrium bisulfit pada pH yang diatur untuk menghambat reaksi biokimia misal perubahan warna. Disintegrasi dan sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan pati dari komponen lainnya (Cui 2005).
2.5 Ragi
Ragi adalah kelompok jamur uniseluler berukuran 5-20 µm yang umum
dipergunakan untuk fermentasi roti dan minuman beralkohol, lebih dari seribu spesies ragi telah teridentifikasi hingga saat ini dan yang paling umum
dipergunakan adalah Saccharomyces cerevisiae Hansen (Muslimin 1996).
fakultatif. Ragi memproduksi energi dalam kondisi ketiadaan oksigen dengan
mengubah gula menjadi etanol dan karbon dioksida. S. cerevisiae berkembang
biak dengan spora dan juga berkembang biak secara vegetative dengan cara penguncupan multilateral. Konjugasi isogami atau heterogami dapat terjadi setelah pembentukan askus yang berbentuk tonjolan-tonjolan, setiap askus mengandung satu sampai empat spora dengan berbagai bentuk spora yang dapat berkonjugasi (Pelczar dan Chan 1988).
Etanol adalah produk yang diinginkan dalam pembuatan minuman beralkohol. Dalam pembuatan roti, yang diinginkan adalah peran karbon dioksida sehingga roti dapat mengembang sedangkan etanol yang terbentuk dibiarkan menguap. Sebuah sel ragi mampu memfermentasi glukosa dengan massa yang sama dengan massa selnya sendiri dalam jangka waktu satu jam. Ragi dapat bereproduksi secara aseksual dengan membentuk tunas ataupun secara seksual
dengan pembentukan ascospora. Selama proses reproduksi aseksual, sebuah tunas
baru tumbuh dari ragi dengan kondisi tertentu dan saat mencapai ukuran dewasa ia akan melepaskan diri dari sel induknya. Reproduksi seksual ragi umumnya berlangsung pada kondisi kekurangan nutrisi pertumbuhan dengan cara
pembentukan ascospora (European Bioinformatics Institute 1996).
Saccharomyces cerevisiae Hansen adalah ragi dari famili saccharomycetaceae. Famili Saccharomycetaceae adalah famili ragi dari ordo
saccharomycetales yang bereproduksi dengan pembentukan tunas. Saccharomyces
cerevisiae Hansen telah lama dimanfaatkan dalam pembuatan roti dan minuman
beralkohol. Ragi S. cerevisiae Hansen diperoleh dari hasil isolasi mikroorganisme
pada kulit anggur. S. cerevisiae Hansen dapat tumbuh secara aerob pada substrat
glukosa, maltose, laktosa dan selobiosa. Fruktosa dan galaktosa merupakan substrat terbaik untuk pertumbuhan ragi ini (Kusmiyati 2010).
Ragi S. cerevisiae Hansen, selain dipergunakan dalam fermentasi juga
dimanfaatkan sebagai suplemen nutrisi karena ragi tersebut mengandung mineral yaitu selenium dan chromium serta vitamin B complex yang meliputi vitamin B1 (thiamine), B2 (riboflavin), B3 (niacin), B5 (asam pantotenat), B6 (piridoxin), B7
(biotin) dan B9 (asam folat). Ragi S. cerevisiae Hansen tidak mengandung vitamin
ragi S. cerevisiae Hansen berfungsi untuk menunjang kerja sistem saraf dan otot-otot saluran pencernaan serta memelihara kesehatan kulit, mata dan hati. Sumber ragi dapat berasal dari buah-buahan, bunga dan daun. Ragi adalah mikroorganisme yang bersifat saprofit dan umumnya serangga adalah yang
berperan memindahkan ragi dari satu tanaman ke tanaman ke tanaman lain
(Shen et al. 2008).
Laju pertumbuhan mikroorganisme dapat dibagi menjadi empat fase, yaitu
fase pertumbuhan lambat (lag phase), fase pertumbuhan cepat (exponential
phase), fase pertumbuhan statis (stationer phase) dan fase kematian (death phase)
(Shen et al. 2008). Laju pertumbuhan mikroorganisme dapat dilihat pada
Gambar 4.
Gambar 4 Kurva pertumbuhan mikroba
Fase lag merupakan fase khamir beradaptasi untuk menyesuaikan dengan substrat dan kondisi lingkungan sekitarnya. Fase ini juga terjadi pertumbuhan yang masih lambat. Fase ekponensial merupakan fase khamir membelah dengan cepat dan konstan. Fase statis merupakan fase populasinya sel khamir tetap karena jumlah sel yang mati sama dengan jumlah sel yang tumbuh. Ukuran sel pada fase ini lebih kecil karena sel tetap membelah meskipun zat nutrisi sudah mulai habis. Fase kematian merupakan fase sebagian populasi khamir mulai mengalami kematian yang disebabkan karena nutrient sudah habis dan energi cadangan dalam sel juga habis (Fardiaz 1992).
2.6Hidrolisis Asam
Konversi selulosa menjadi glukosa dapat dilakukan dengan menggunakan hidrolisis secara asam. Hidrolisis asam dapat dilakukan dengan menggunakan
asam pekat H2SO4 72% dan HCl 42% pada suhu ruang. Selain itu juga bisa
dilakukan dengan larutan asam 1% pada suhu 100-200 oC selama 3 jam.
Karbohidrat dapat dirombak secara hidrolisis dalam suasana asam menjadi gula sederhana yang akan dijadikan sumber makanan bagi khamir, selanjutnya gula ini difermentasi (Greethlein 1978).
Hidrolisis asam dapat dikategorikan melalui dua pendekatan umum, yaitu hidrolisis asam konsentrasi tinggi pada suhu rendah dan konsentrasi rendah pada suhu tinggi. Pemilihan antara dua cara tersebut pada umumnya didasarkan pada beberapa pertimbangan yaitu laju hidrolisis, tingkat degradasi, produk dan biaya total proses produksi. Hidrolisis asam konsentrasi tinggi akan lebih ekonomis jika
asam dapat diperoleh kembali (recovery). Akan tetapi, asam kuat bersifat korosif,
sehingga memerlukan teknik khusus dan biaya tambahan untuk perawatan alat produksi (Kosaric dan Velayudhan 1991).
Asam yang biasa digunakan untuk menghidrolisis selulosa adalah asam sulfat, asam klorida, dan asam fosfat. Hidrolisis selulosa dengan asam untuk menghasilkan gula, pada proses ini juga terbentuk 5-hidroksi metil-2-5 furfuraldehid atau hidroksimetilifurfural (HMF) sebagai bentuk dari penguraian glukosa pada suasana asam, HMF ini akan bereaksi membentuk asam-asam organik, yakni asam levinulinat dan asam formiat pada suasana asam dan suhu tinggi (Greethlein 1978).
2.7 Bioetanol
Bioetanol adalah etanol yang dibuat dari proses fermentasi yang
mengandung komponen pati atau selulosa, misal singkong dan tetes tebu. Dalam dunia industri, etanol umumnya dipergunakan sebagai bahan baku industri turunan alkohol, campuran untuk minuman keras (misal sake atau gin), serta bahan baku farmasi dan kosmetika. Berdasarkan kadar alkoholnya, etanol terbagi menjadi tiga
grade sebagai berikut: (Prihardanadan Samsuri 2008).
Grade industri dengan kadar alkohol 90-94%,
Netral dengan kadar alkohol 96-99,5%, umumnya digunakan untuk
minuman keras atau bahan baku obat dalam industri farmasi,
Grade bahan bakar dengan kadar alkohol diatas 99,5%.
Secara umum produksi bioetanol mencakup tiga rangkaian proses yaitu, persiapan bahan baku, fermentasi dan pemurnian. Bahan baku bioetanol bisa diperoleh dari berbagai tanaman yang menghasilkan gula misal tebu dan molase dan juga tanaman penghasil pati atau tepung yakni jagung, singkong dan juga sagu. Pada tahapan persiapan, bahan baku berupa padatan harus dikonversi terlebih dahulu menjadi larutan gula sebelum akhirnya difermentasi untuk menghasilkan etanol, sedangkan bahan-bahan yang sudah dalam bentuk larutan gula misal molase dapat secara langsung difermentasi. Bahan padatan dikenai perlakuan pengecilan ukuran dan juga tahap pemasakan. Proses pengecilan ukuran dapat dilakukan dengan menggiling bahan (singkong, sagu, dan jagung) sebelum memasuki tahap pemasakan. Tahap pemasakan bahan meliputi proses liquifikasi
dan sakarifikasi. Pada tahap ini, tepung/pati dikonversi menjadi gula
(Hambali et al. 2008).
Tahap fermentasi merupakan tahap kedua dalam proses produksi bioetanol. Pada tahap ini terjadi proses pemecahan gula-gula sederhana menjadi etanol dengan melibatkan enzim dan ragi. Fermentasi dilakukan pada suhu sekitar
27 – 32 0C. Pada tahap ini akan dihasilkan gas CO2 sebagai by product dan sludge
sebagai limbahnya. Gas CO2 yang dihasilkan memiliki perbandingan stoikiometri
yang sama dengan etanol yang dihasilkan yaitu 1:1. Setelah melalui proses
pemurnian, gas CO2 dapat digunakan sebagai bahan baku gas dalam minuman
berkarbonat (Hambali et al. 2008).
Tahap berikutnya adalah pemurnian bioetanol yang diperoleh. Tahap ini dilakukan dengan metode destilasi. Destilasi dilakukan pada suhu diatas titik didih
etanol murni yaitu pada kisaran 78–100 0C. Produk yang dihasilkan pada tahap ini
memiliki kemurnian hingga 96%. Etanol hasil destilasi kemudian dikeringkan melalui metode purifikasi untuk meningkatkan kemurnian etanol hingga
memenuhi spesifikasi bahan bakar ataupun untuk keperluan industri
(Hambali et al. 2008).
2.6.2 Sakarifikasi
Ragi tidak dapat langsung memfermentasikan pati. Oleh karena itu diperlukan tahap sakarifikasi, yakni perubahan pati menjadi maltose atau glukosa dengan menggunakan enzim atau asam. Dengan memanfaatkan enzim pengurai
pati dari mikroorganisme, konversi pati untuk menghasilkan maltose dan dekstrin yang tidak terfermentasi terjadi karena hidrolisis enzimatis. Komposisi kimia dari pati adalah amilosa dan amilopektin. Amilosa merupakan polimer dari glukosa yang merupakan rantai lurus dan secara kuantitatif amilosa dapat dihidrolisis menghasilkan maltose sedangkan amilopektin hanya akan terhidrolisis sebagian. Pati jagung yang disakarifikasi akan menghasilkan 80% maltose dari total pati dan
sisanya disebut limit dekstrin (Hidayat et al. 2006).
2.6.3 Fermentasi
Tahap inti dari produksi bioetanol adalah fermentasi gula sederhana, baik yang berupa glukosa, sukrosa, maupun fruktosa dengan menggunakan ragi/yeast
terutama Saccharomyces sp. atau bakteri Zymomonas mobilis. Dalam proses ini,
gula akan dikonversi menjadi etanol dan gas karbon dioksida (Nowak 2000). Fermentasi dapat didefenisikan sebagai perubahan gradual oleh enzim beberapa bakteri, ragi, dan jamur. Contoh perubahan kimia dari fermentasi meliputi pengasaman susu, dekomposisi pati dan gula menjadi alkohol dan karbon
dioksida, serta oksidasi senyawa nitrogen organik (Wilkins et al. 2007). Bahan
dasar untuk kebutuhan fermentasi dapat berasal dari hasil pertanian, perkebunan, maupun limbah industri. Bahan dasar yang umum dipergunakan di negara berkembang adalah:
1) Molase (karena banyaknya tebu di negara tersebut).
2) Pati (gandum, jagung, beras, dll.)
3) Jerami
4) Dedak
5) Kulit kopi, kulit coklat, sabut kelapa.
6) Ampas tebu, ampas biji-bijian yang telah diambil minyaknya.
7) Kotoran binatang
8) Air limbah.
9) Sampah sebagai komponen pupuk
10) Sisa pabrik kertas, pabrik susu, dan sebagainya.
Penggunaan inokulum murni dalam fermentasi akan memperbaiki mutu produk dan mengurangi kontaminasi. Inokulum tradisional yang umum dipakai masyarakat awam adalah sumber kontaminan karena mikroorganisme di dalamnya
tidak diketahui secara pasti. Adanya mikroorganisme penghasil pigmen, terutama kapang akan menyebabkan produk fermentasi menjadi berwarna, berasa asam dan memiliki bau yang asing. Inokulum atau ragi yang ditambahkan dalam fermentasi
biasanya kurang dari 1%. Umumnya jumlah ragi yang dipakai adalah 0,2–0,5%
(Hidayat et al. 2006).
Secara garis besar, fermentasi karbohidrat oleh ragi dapat dibagi menjadi
dua tahap (Judoamidjojo et al.1992), yaitu :
1) Pemecahan karbohidrat (pati) menjadi gula pereduksi
Pemecahan karbohidrat menjadi gula pereduksi karena difermentasi oleh
enzim diastase dan zymase yang terkandung dalam ragi, seperti terlihat pada
reaksi berikut :
2(C6H10O5)n + nH2O diastase nC12H22O11 pati Maltosa C12H22O11 Zymase C6H12O6
Maltosa Glukosa
2) Perubahan gula pereduksi menjadi etanol
Perubahan gula pereduksi menjadi etanol dilakukan oleh enzyme invertrase, yaitu enzim kompleks yang terkandung dalam ragi. Reaksinya adalah sebagai berikut :
C6H12O6invertase 2C2H5OH + 2CO2 + 2 ATP
gula etanol + karbondioksida+(Energi=118 kJ per mol)
Ditinjau dari reaksi diatas, dapat dilihat bahwa oksigen (O2) ternyata tidak
diperlukan, hanya pengubahan zat organik yang satu menjadi zat organik yang lain (glukosa menjadi etanol)
3) Fermentasi asam asetat
Merupakan kelanjutan dari proses fermentasi alkohol. Proses dimulai dari proses pemecahan gula menjadi alkohol, selanjutnya alkohol menjadi asam asetat. 2C2H5OH + 2CO2 bakteri 2CH3COOH + 2H2O
Bakteri yang aktif : Acetobacter aceti
Acetobacter paseurianum Acetobacter oxydans
2.6.4 Destilasi
Kadar etanol hasil fermentasi tidak dapat mencapai level diatas 18 hingga
21%, sebab etanol dengan kadar tesebut bersifat toxic terhadap ragi yang
memproduksi etanol tersebut sehingga untuk memperoleh etanol dengan kadar yang lebih tinggi perlu dilakukan destilasi. Destilasi adalah proses pemanasan yang memisahkan etanol dan beberapa komponen cair lain dari substrat fermentasi sehingga diperoleh kadar etanol yang lebih tinggi (Jirasak dan Sornvoraweat 2011).
Tujuan proses destilasi adalah untuk memisahkan etanol dari campuran
etanol-air. Titik didih etanol adalah 78 0C dan titik didih air adalah 100 0C
sehingga dengan pemanasan pada suhu 78 0C dengan metode destilasi maka etanol
dapat dipisahkan dari campuran etanol-air. Konsentrasi maksimum etanol yang dapat diperoleh dengan cara destilasi adalah 96%. Etanol anhidrat (99,5%-100%) dapat diperoleh dengan menggunakan metode destilasi azeotrop menggunakan benzen (Waller 1981).
Campuran azeotrop etanol-air dapat dipisah dengan penambahan benzen dimana akan terbentuk campuran azeotrop benzen-etanol-air dengan titik didih
64,9 0C. Titik didih campuran tersebut lebih rendah dari campuran etanol-air
(78,2 0C) sehingga etanol dapat dipisahkan dari air dengan destilasi bertingkat,
namun pemisahan etanol dengan metode ini akan menyisakan beberapa ppm
residu benzene di dalam etanol yang diperoleh. Benzen adalah bahan yang toxic
bagi manusia, selain itu penggunaan metode ini juga menghasilkan etanol yang tidak murni sehingga metode ini tidak banyak dipergunakan (Graham 2003).
Metode alternatif yang dapat dipergunakan untuk memperoleh etanol
dengan kadar 100% dari etanol 96% adalah dengan menggunakan molecular
sieve, yakni suatu absorben sintetis berbentuk pellet yang dapat secara selektif mengikat molekul air. Selain murah harganya, metode ini tidak meninggalkan residu pada etanol yang diperoleh (Mathewson 1980).
3 METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari-April 2012. Penelitian analisis komposisi kimia dan pembuatan bioetanol buah lindur dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor, penelitian histologi buah lindur dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Hewan, Intitut Pertanian Bogor dan pengujian kadar bioetanol di Laboratorium Terpadu, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari bahan utama,
yaitu dari buah lindur (B. gymnorrhiza) yang diperoleh dari Pulau Kaya, Kota
Tual, Kabupaten Maluku Tenggara dan bahan untuk perhitungan proksimat misal
akuades, HCl, NaOH, katalis selenium, H2SO4, H3BO3 dan pelarut heksana.
Bahan untuk pembuatan bioetanol adalah gula pasir, HCl, NaOH, pupuk NPK
(Natrium, Posfor, Kalium), pupuk ZA (zwavelzuur ammonia), isolat
Saccharomyces cerevisiae, PDA (Potato Dextrose Agar), PDB (Potato Dextrose Broth). Sedangkan bahan–bahan yang digunakan untuk pewarnaan preparat adalah
parafin, xylol, toluidine blue, etanol, larutan seri Johansen, FAA.
Alat-alat yang digunakan antara lain mikroskop merk Olympus BH-2,
kromatografi gas SupelcoTM 37 Component FAME Mix, beker glass 2 L, kompor
listrik, alat pengaduk, timbangan digital, pH meter, gelas ukur 100 ml, saringan, spatula, pipet volumetrik, piknometer, selang (d=3 mm), toples kaca 300 ml, alumunium foil, jarum ose, blender, parutan kelapa, pisau, plastik, baskom,
inkubator, autoclave, thermometer, cawan porselen, oven, desikator, tabung
reaksi, gelas erlenmeyer, tabung Kjeldahl, tabung soxhlet, buret, mortar, tanur,
3.3Metode Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode eksperimen di Laboratorium sesuai dengan prosedur kerja. Penelitian ini terdiri dari dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan meliputi karakterisasi bahan baku (buah lindur), analisis histologi, uji proksimat, pembuatan starter (regenerasi kultur dan starter media cair), pembuatan media fermentasi,
penambahan nutrient, pengaturan pH dan pasteurisasi. Penelitian utama meliputi
pembuatan bioetanol, yaitu fermentasi alkohol, pelakuan inkubasi, dan pengujian (uji pH akhir dan uji kadar etanol).
3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel
Penelitian ini diawali dengan pengambilan dan preparasi sampel buah
lindur (B. gymnorrhiza). Buah lindur ditemukan di daerah mangrove dan banyak
terkena sinar matahari. Setelah sampel buah lindur diperoleh kemudian dibawa
dengan cool box hingga ke laboratorium kemudian dicuci dengan air bersih untuk
menghilangkan benda asing yg menempel lalu dikeringkan di bawah sinar matahari.
3.3.2 Pembuatan preparat dengan metode parafin dan pengamatan
Pengamatan jaringan tanaman diawali dengan pembuatan preparat
tanaman lindur (B. gymnorrhiza) kemudian pengambilan gambar objek pada
mikroskop. Pembuatan preparat dilakukan dengan metode parafin. Tahapannya terdiri atas fiksasi, pencucian, dehidrasi dan penjernihan, infiltrasi, pemurnian dalam blok, penyayatan, perekatan, dan pewarnaan. Bagian tanaman lindur yang diambil adalah daun, batang dan daun.
Fiksasi dilakukan selama >24 jam (5 hari) dalam larutan FAA, setelah itu larutan fiksasi dibuang dan sampel dicuci dengan etanol 50% sebanyak 4 kali dengan waktu penggantian masing-masing selama 30 menit. Kemudian didehidrasi dan dijernihkan secara bertahap melalui perendaman dalam larutan seri Johansen pada suhu ruang. Proses infiltrasi dimulai dari perendaman sampel dalam TBA dengan minyak parafin dengan perbandingan 1 : 1 dan 1/3 parafin beku dan disimpan pada suhu ruang selama 4 jam yang dilanjutkan pengovenan
pada suhu 58 oC selama 18 jam. Pergantian parafin dilakukan setiap 5 jam sekali
Proses penanaman dilakukan dengan cara sampel dari tahap infiltrasi dimasukkan ke dalam blok kotak yang berisi parafin cair dan disimpan pada suhu ruang hingga benar-benar membeku. Proses penyayatan dilakukan dengan menggunakan mikrotom putar setebal 10 µm. Blok parafin terlebih dahulu
dipotong dan dirapihkan kemudian ditempelkan pada holder lalu disayat. Hasil
sayatan direkatkan pada gelas objek yang telah diolesi albumin-gliserida dan
ditetesi air. Gelas berisi pita parafin kemudian dipanaskan pada hot plate dengan
suhu 45 oC selama 3-5 jam. Pewarnaan dilakukan dengan toluidin blue.
Proses selanjutnya adalah penutupan dengan pemberian entellen atau
canada balsam pada gelas objek dan ditutupi dengan gelas penutup. Proses pengambilan gambar dilakukan dengan mikroskop cahaya. Diagram alir pembuatan preparat dengan metode parafin, pewarnaan dan pengamatan disajikan pada Gambar 5.
Tumbuhan Lindur (daun, batang dan buah)
Pewarnaan
Pengamatan dengan mikroskop
Pemotongan dengan panjang 2 cm dan tebal 0,1 mm
Fiksasi FAA
Pencucian dengan etanol
Infiltrasi dengan parafin
Penanaman dalam parafin
Penyayatan blok parafin
Gambar 5 Diagram alir pembuatan preparat dengan metode parafin.
3.3.3 Analisis Proksimat
Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia yang ada pada suatu bahan. Analisis proksimat