C. METODE PENELITIAN
3. PENELITIAN BAGIAN III
Pada penelitian bagian ketiga dilakukan pengujian nilai biologi I, Fe dan vitamin A dari produk kecap dan saus cabe menggunakan hewan
PROD U K
Kecap Saus cabe
PEN YI M PAN AN Suhu : 27°C
PEN GUJI AN KAN D UN GAN ZAT GI ZI I ODI UM , BESI , VI T. A
Periode penguj ian : hari ke- 0, 14, 28, 42, 56
PEN D UGAAN POLA STABI LI TAS ZAT GI ZI I ODI UM , BESI , VI T. A
pengujian manfaat iodium pada kedua produk tersebut dalam mempengaruhi kemampuan belajar tikus percobaan.
Bagan alir selengkapnya dari penelitian tahap ketiga ini dapat dilihat pada Gambar 6.
Gambar 6 Bagan alir penelitian bagian III PENGELOMPOKAN TIKUS PERCOBAAN
Tikus Betina umur sapih (21 hari), dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan yaitu :
1. Tidak diberi sumber I dan Fe dari ransum, tidak diberi kecap dan saus cabe (kontrol -)
2. Diberi sumber I dan Fe dari ransum, tidak diberi kecap dan saus cabe (normal)
3. Tidak diberi sumber I dan Fe dari ransum, diberi kecap 4. Tidak diberi sumber I dan Fe dari ransum, diberi saus cabe 5. Tidak diberi sumber I dan Fe dari ransum, diberi KIO3
Keterangan : - Periode perlakuan 30 hari
- Masing- masing perlakuan terdiri dari 8 tikus
- Kecap dan saus cabe diberikan secara oral dengan dosis 1,8 g/kg BB/hari
PENGAMATAN TIKUS PERCOBAAN A. PENIMBANGAN BERAT BADAN TIKUS
Penimbangan berat badan terhadap masing- masing kelompok perlakuan setiap 2 hari sekali selama 30 hari
B. PENGAMATAN KEMAMPUAN BELAJAR
Setelah 30 hari perlakuan, dilakukan pengukuran kemampuan belajar tikus percobaan dengan menggunakan tes mendapatkan makanan (food retrieval test) (Suprijana, 1992)
PEMBEDAHAN TIKUS § 2 tikus untuk masing- masing
perlakuan § Pengamatan :
1. ? sel neuron otak 2. Hb serum
3. Retinol serum
TIKUS DIKAWINKAN § 5 tikus untuk masing-
masing perlakuan
TIKUS HAMIL Pengamatan :
§ Penimbangan BB tikus selama kehamilan
a. Pengujian Biokimia Darah 1). Pengambilan Darah
§ Darah diambil dari vena tikus, dimasukkan ke dalam 2 tabung, yaitu : (1) Tabung tanpa EDTA, (2) Tabung berisi EDTA 10%. Dimasukkan ice box untuk dianalisis di laboratorium.
§ Darah dalam tabung 1 disentrifuse (3000 rpm, 10 menit). Bagian serum dipisahkan dan dimasukkan ke dalam ampul serum. Serum digunakan untuk analisis kandungan retinol. § Darah dalam tabung 2 siap dianalisis kandungan Hb-nya. 2). Pemeriksaan Hb Serum (Lampiran 4)
3). Pemeriksaan Retinol (vitamin A) Serum (Lampiran 3)
b. Pengamatan Kemampuan Belajar
Pengukuran kemampuan belajar tikus percobaan dilakukan dengan menggunakan tes mendapatkan makanan (food retrieval test) dengan menggunakan alat labirin pengujian kemampuan belajar tikus.
Alat pengujian kemampuan belajar tikus dibuat dari kayu dengan ukuran 120 cm x 60 cm x 15 cm (Gambar 7). Bagian dalam kotak diberi banyak penyekat. Penyekat ruangan dimaksudkan untuk membingungkan tikus, sehingga untuk memperoleh makanan ia harus mencari jalan yang paling mudah.
Gambar 7 Alat pengujian kemampuan belajar tikus
Prinsip tes ini adalah mengukur waktu yang diperlukan tikus yang diletakkan pada posisi Start (S) untuk mendapatkan makanan yang diletakkan pada posisi Finish (F). Pengukuran kemampuan
belajar dilakukan pada tikus dewasa berumur 60 hari dan anak tikus berumur 30 hari.
Beberapa hari sebelum pengujian, tikus dilatih dari posisi S dan dibimbing melalui lintasan untuk mencapai posisi F. Latihan dilakukan beberapa kali dengan frekuensi yang sama untuk masing- masing perlakuan. Pada saat pengujian, tikus diletakkan pada posisi S dan waktu yang dibutuhkan untuk mencapai posisi F dicatat dalam detik.
c. Analisis Jumlah Sel Neuron
Satu hari setelah pengukuran terakhir kemampuan belajar, tikus dibedah untuk dianalisis histologi otak dan dilakukan penghitungan jumlah sel neuronnya. Bagian otak yang diamati yaitu serebri otak kiri bagian tengah. Untuk anak tikus pengambilan organ otak dilakukan pada saat tikus berumur 4 hari dan 30 hari (setelah uji kemampuan belajar). Sebelum dilakukan pembedahan terlebih dahulu tikus dimatikan dengan cara menarik bagian kepala dan ekor hingga ruas- ruas tulang belakangnya putus. Setelah itu dilakukan pembedahan kepala untuk mengambil otaknya. Otak difiksasi dengan larutan bouin (asam pikrat jenuh : formalin : asam asetat = 15 : 5 : 1) selama 24 jam. Setelah itu otak direndam dalam alkohol 70%, kemudian dipotong kecil-kecil dan dimasukkan ke dalam keranjang serta diberi label sebelum proses dehidrasi.
Proses dehidrasi sampel jaringan dengan mencelupkan ke dalam alkohol 70%. Penyimpanan dalam alkohol 70% dapat dilakukan dalam waktu yang lama dan dapat berfungsi sebagai stopping point. Proses dehidrasi selanjutnya adalah perendaman jaringan dalam alkohol 80%, 90% dan 95% masing- masing selama 24 jam serta perendaman dalam alkohol absolut I, II, III masing- masing selama 1 jam.
Tahap selanjutnya yaitu proses penjernihan atau clearing
dengan memasukkan jaringan ke dalam xylol I, xylol II dan xylol III masing- masing selama 1 jam. Perlakuan pada xylol III dibagi dalam
dua tempat yaitu 30 menit di suhu ruang dan 30 menit di inkubator suhu 62°C untuk preadaptasi.
Setelah proses penjernihan, dilakukan infiltrasi pada jaringan dengan mencelupkannya dalam parafin I, parafin II dan parafin III pada suhu 62°C masing- masing selama 1 jam. Otak yang telah didehidrasi diblok dengan parafin sampai memadat (embedding). Proses embedding dilakukan dengan alat tisue embedding console. Setelah padat dilakukan pemotongan otak dengan ukuran 5 mikron berbentuk pita dengan alat mikrotom. Pita yang dihasilkan diapungkan dalam air dingin dan diseleksi untuk mendapat sayatan yang baik. Sayatan yang baik diapungkan di permukaan air hangat (40°C) kemudian dipindahkan pada gelas objek lalu diperiksa di bawah mikroskop. Objek gelas tersebut diletakkan diatas hot plate selama 10- 15 menit. Kemudian jaringan dimasukkan dalam inkubator 40°C sela ma satu malam sebelum pewarnaan.
Pewarnaan preparat dilakukan dengan menggunakan dua pewarna yaitu Hematoksilin- Eosin (HE). Sebelumnya dilakukan deparafinisasi dengan mencelupkan jaringan dalam xylol III, xylol II, xylol I maing- masing 3-5 menit. Kemudian rehidrasi dengan merendam jaringan dalam alkohol absolut III, II, I, alkohol 95%, 90%, 80%, 70% masing- masing selama 3-5 menit. Selanjutnya dicuci dengan akuades selama 15-30 menit, perendaman dalam akuades 5 menit. Pencucian dengan air kran dilakukan kembali selama 15-30 menit, perendaman dalam akuades 5 menit lalu pewarnaan dengan Eosin alkohol selama 1-2 menit dan dicuci lagi dengan akuades. Selanjutnya dilakukan dehidrasi dengan merendam jaringan dalam alkohol 70%, 80%, 90%, absolut I, II dan III serta xylol I, II, III. Preparat kemudian ditutup dengan gelas penutup dan siap untuk diobservasi dengan mikroskop dan selanjutnya dilakukan pemotretan.
Analisis terhadap histologi otak dilakukan dengan menggunakan mikroskop yang dilengkapi dengan kamera. Jumlah sel neuron dihitung per lapang pandang dengan pembesaran 200 kali pada