BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
B. Penetapan Kadar Beta Karoten dalam Filtrat Perasan
Beta karoten dalam penelitian ini digunakan sebagai senyawa penanda, karena beta karoten merupakan kandungan terbesar dalam wortel dibandingkan senyawa lainnya. Sebagai standarisasi kandungan kimia dari sediaan gel yang dibuat maka sebelum dilakukan pembuatan gel, perlu diketahui terlebih dahulu kandungan beta karoten dari filtrat wortel yang akan dimasukkan ke dalam sediaan.
Prosedur ekstraksi yang dilakukan mengacu pada prosedur pengisolasian beta karoten dari sayuran segar menurut yang tercantum dalam Analytical method of AOAC dengan sedikit modifikasi pada bagian-bagian yang diperlukan (Anonim, 1995b). Pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi ini adalah campuran dengan perbandingan 1 bagian aseton dan 9 bagian heksan.
Ekstraksi beta karoten dari filtrat perasan wortel dilakukan dengan bantuan pengadukan menggunakan magnetic strirer. Langkah awal adalah
menimbang sampel filtrat perasan wortel secara seksama sebanyak 0,5 gram, sampel kemudian diekstrak dengan 25 ml aseton lalu distirrer selama 2,5 menit. Hasil ekstraksi ini disaring dengan kertas saring dan ditampung dalam erlemeyer. Endapan yang masih tersisa kemudian distirrer lagi dengan 25 ml aseton selama 2,5 menit.
Hasil ekstraksinya kemudian kembali disaring dengan kertas saring dan dijadikan satu dengan hasil ekstraksi tahap I pada erlemeyer. Proses ekstraksi dilakukan secara bertahap, tujuannya adalah untuk mendapatkan kadar beta karoten dalam jumlah yang lebih besar daripada jika hanya dilakukan 1 kali tahap ekstraksi.
Proses ekstraksi dilanjutkan dengan penambahan 25 ml heksan dan distirrer selama 1 menit lagi. Kemudian hasilnya disaring dan disatukan dengan hasil ekstraksi dengan aseton pada erlemeyer. Waktu yang dibutuhkan untuk pencucian heksan lebih singkat karena intensitas warna filtrat sesudah mengalami pencucian dengan aseton sudah memudar, diasumsikan sebagai tanda bahwa kandungan beta karoten sudah banyak yang terlarut dalam aseton.
Penambahan heksan bertujuan untuk memisahkan beta karoten dengan komponen lain yang bersifat polar yang terdapat dalam filtrat perasan wortel sehingga beta karoten banyak yang masuk ke pelarut heksan. Hal ini disebabkan heksan lebih bersifat non polar daripada aseton.
Hasil ekstraksi kemudian ditempatkan ke dalam corong pisah, fase aseton dihilangkan dengan penambahan 100 ml aquadest dan penggojogan selama 2 menit. Tujuan penggojogan yaitu diharapkan fase aseton lebih terikat pada air
karena polaritasnya yang mirip sehingga beta karoten hanya terdapat dalam fase heksan. Setelah penggojogan akan tampak 2 fraksi dalam corong pisah, fraksi
aquadest yang mengikat aseton dan fraksi heksan. Beta karoten dalam fraksi aseton diharapkan terikat pada fraksi heksan ketika fraksi aseton terikat pada molekul air, karena heksan kepolarannya lebih rendah daripada aseton sehingga diharapkan beta karoten yang bersifat non polar lebih terikat pada heksan daripada pada aseton.
Fraksi heksan yang telah didapat diekstraksi 4 kali lagi menggunakan 100 ml aquadest dengan prosedur yang sama. Tujuan penambahan aquadest
adalah untuk menghilangkan sisa-sisa aseton. Fraksi heksan yang didapat dikumpulkan pada labu ukur 25 ml lalu ditambahkan pelarut campuran aseton-heksan (1:9) sampai tanda batas, tujuan penambahan pelarut adalah untuk menyeragamkan volume dalam perhitungan kadar beta karoten.
1. Penetapan kadar beta karoten dan nilai SPF sebelum dibuat sediaan gel Penetapan kadar beta karoten perlu dilakukan untuk digunakan sebagai kontrol terhadap kandungan beta karoten yang terdapat dalam sediaan gel UV protection. Sebelum filtrat wortel dimasukkan dalam sediaan maka terlebih dahulu perlu ditetapkan kadar beta karoten di dalamnya supaya kadar beta karoten yang dimasukkan dalam tiap formula selalu sama. Untuk mengetahui kadar beta karoten di dalam filtrat wortel digunakan metode spektrofotometri. Sebagai baku digunakan beta karoten (E Merck®,USA).
Seri larutan baku beta karoten dibuat dengan menimbang 10 mg beta karoten kemudian dilarutkan dalam 25 ml pelarut aseton:heksan (1:9). Kemudian
dibuat larutan intermediet dengan pengenceran 10 kali larutan stok. Seri larutan baku dibuat dengan konsentrasi 2; 4; 6; 8; dan 10 ppm dan dibuat replikasi sebanyak 3 kali, untuk mencari nilai r (linearitas) persamaan baku yang paling signifikan yaitu mendekati 1. Dengan demikian dapat digunakan untuk menghitung kadar beta karoten dari filtrat perasan wortel.
Langkah berikutnya yang dilakukan adalah scanning panjang gelombang serapan maksimum larutan baku beta karoten. Scanning panjang gelombang dilakukan dengan menggunakan spektofotometer GENESIS 10 pada range panjang gelombang 200-700 nm, pada konsentrasi 2 ppm, 6 ppm, dan 10 ppm. Pada konsentrasi tersebut panjang gelombang maksimum yang didapat adalah 452 nm. Padahal panjang gelombang teoritis menurut AOAC adalah 436 nm, ini berarti terdapat pergeseran panjang gelombang yang cukup jauh antara panjang gelombang hasil pengukuran dan teoritis. Tetapi yang digunakan untuk penetapan kadar beta karoten adalah panjang gelombang maksimum 452 nm.
Pergeseran ini mungkin disebabkan karena adanya pergeseran batokromik beta karoten oleh pelarut aseton-heksan sehingga panjang gelombang maksimum yang dihasilkan lebih panjang dari teoritisnya. Atau dimungkinkan juga karena kondisi seperti suhu dan kelembaban udara yang berbeda dari acuan sehingga mempengaruhi hasil pengukuran. Selain itu mungkin juga disebabkan oleh beberapa hal yaitu adanya perbedaan kondisi baku beta karoten yang digunakan, kemungkinan spektrofotometer yang digunakan untuk mengukur serapan juga berbeda, selain itu praktikan yang melakukan pengukuran juga
berbeda sehingga memiliki cara mengukur dan ketelitian yang berbeda juga. Akibatnya hasil pengukurannya juga berbeda.
Ta be l V I . Ku r v a ba k u be t a k a r ot e n de n ga n Spe k t r ofot om e t e r Ge n e sis
KURVA BAKU I KURVA BAKU II KURVA BAKU III Kadar (ppm) Absorbansi Kadar (ppm) Absorbansi Kadar (ppm) Absorbansi 2,174 0,262 2,160 0,243 2,056 0,336 4,348 0,541 4,320 0,626 4,112 0,570 6,522 0,930 6,480 0,986 6,168 0,980 8,696 1,200 8,640 1,291 8,224 1,320 10,870 1,509 10,800 1,629 10,280 1,622 A = 0,0575 B = 0,14503 r = 0,99855 y = 0,14503 x + 0,0575 A = – 0,0761 B = 0,15912 r = 0,99915 y = 0,15912 x – 0,0761 A = -0,031 B = 0,16158 r = 0,99729 y = 0,16158 x - 0,0310
Dari hasil perhitungan kadar dan absorbansi ketiga seri larutan baku diatas menggunakan metode regresi linear, didapatkan 3 persamaan dengan nilai r (regresi) yang berbeda. Ketiga persamaan tersebut memiliki nilai r yang lebih besar dari pada nilai r tabel (r tabel = 0,878) dengan taraf kepercayaan sebesar 95 %, sehingga didapatkan kesimpulan bahwa ketiga persamaan tersebut linear.
Berdasarkan nilai r dari ketiga seri larutan baku tersebut, didapati bahwa pada seri larutan baku II memiliki nilai r yang paling mendekati 1, yaitu sebesar 0,99915. Semakin tinggi nilai regresi menunjukkan semakin baik hubungan sebab akibat antara variabel bebas dan variabel tergantung. Dalam penetapan kadar ini hubungan yang dimaksud adalah bahwa perubahan nilai kadar benar-benar mempengaruhi nilai absorbansi yang didapat, sehingga untuk perhitungan kadar digunakan persamaan y = 0,15912x – 0,0761. Hasil dari pengukuran nilai absorbansi sampel adalah sebagai berikut :
Ta be l V I I . Ju m la h be t a k a r ot e n da la m 1 gr a m filt r a t pe r a sa n w or t e l de n ga n Spe ct r oph ot om e t e r Ge n e sis 1 0
filtrat absorbansi Σ beta karoten dalam 1 g filtrat x ± SD (mg) CV (%) 1 1,238 0,13764 mg 2 1,186 0,13220 mg 3 1,251 0,13900 mg 0,13628 ± 0,0036 2,6403
Sun Protection Factor merupakan suatu parameter sediaan sunscreen
yang digunakan untuk mengetahui lamanya perlindungan yang diberikan sediaan
sunscreen untuk dapat memproteksi kulit dari sinar UV jika dibandingkan dengan kondisi normal (tanpa sunscreen).
Beta karoten yang terdapat dalam sediaan gel filtrat wortel diharapkan dapat berpotensi sebagai sunscreen dengan cara mengabsorpsi sinar UV karena beta karoten memiliki gugus terkonjugasi yang cukup banyak pada struktur beta karoten.
Menurut standar FDA suatu sediaan dikategorikan sebagai sunscreen
jika memiliki nilai SPF di atas 15. Namun menurut Stacener (2008) nilai SPF dibatasi dari 4-30 tergantung kondisi geografis dan kondisi normal orang yang menggunakannya. Orang yang tidak mudah terbakar sinar matahari dapat menggunakan sunscreen dengan SPF rendah (4) demikian pula sebaliknya.
Sediaan gel yang akan dibuat pada penelitian ini adalah sediaan yang memiliki SPF medium yaitu antara 10-15. Hal ini dikarenakan untuk kondisi Indonesia hanya diperlukan SPF yang medium saja, karena sebagian kulit orang Indonesia tidak mudah terbakar, mengingat bahwa kulit orang Indonesia memiliki pigmen yang lebih gelap daripada orang Eropa maupun Australia, juga dibandingkan dengan kondisi di kedua benua tersebut yang lapisan ozonnya sudah
mulai menipis dan berlubang sedangkan kondisi lapisan ozon di Indonesia masih lebih baik sehingga dapat menangkal radiasi UV untuk sampai ke permukaan bumi.
Perhitungan nilai SPF dilakukan dengan menggunakan rumus Walters yang mana menunjukkan hubungan antara absorbansi dan nilai SPF.
⎥⎦ ⎤ ⎢⎣ ⎡ = SPF 1 log -A 10 = log10SPF (Walters et al., 1997)
Cara pengukuran SPF dengan rumus ini dianggap cukup sederhana dan mudah dilakukan. Filtrat wortel yang sudah diketahui berapa kadarnya ditimbang dan dilarutkan dalam kloroform untuk kemudian dilakukan scanning menggunakan spektrofotometer GENESIS 10 pada panjang gelombang UV (250-400 nm).
Dipilih menggunakan kloroform karena pelarut ini bersifat relatif lebih polar dibanding pelarut lainnya selain itu UV cut off dari kloroform di bawah 250 nm sehingga kloroform tidak akan menimbulkan serapan pada spektra yang dihasilkan (Day and Underwood, 1996).
Penggunaan kloroform sebagai pelarut dalam uji pengukuran SPF berbeda dengan pelarut yang digunakan untuk penetapan kadar. Hal ini tidak menjadi masalah yang berarti karena jumlah beta karoten yang terlarut pada kedua pelarut tersebut dibawah jumlah kelarutan jenuhnya sehingga dalam hal ini perbedaan pelarut tidak mempengaruhi jumlah beta karoten yang terlarut pada kedua pelarut.
Kedua gambar di bawah ini merupakan perbandingan antara kurva baku dengan sampel filtrat perasan wortel yang dilarutkan dalam kloroform, kemiripan
profil dua puncak yang dimiliki oleh kedua hasil scanning membuktikan bahwa sampel filtrat perasan wortel adalah beta karoten.
Ga m ba r 8 . H a sil sca n n in g ba k u be t a k a r ot e n de n ga n
Spe ct r oph ot om e t e r UV Ge n e sisTM 1 0
Ga m ba r 9 . H a sil sca n n in g filt r a t pe r a sa n w or t e l de n ga n pe la r u t k lor ofor m Spe ct r oph ot om e t e r UV Ge n e sisTM 1 0
Kedua hasil scanning diatas terletak pada panjang gelombang 250-400 nm. Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa serapan beta karoten terletak pada UV A (349-352 nm) dan UV C (271-283 nm). Karena UV C hampir tidak ditemukan dalam alam karena secara total diserap oleh atmosfer atau dengan kata lain masih bisa diproteksi oleh atmosfer bumi maka sediaan sunscreen ditujukan untuk
rentang UV A yaitu pada 320-400 nm. Pengukuran nilai SPF dilakukan pada rentang panjang gelombang UV 365 nm secara in vitro.
Alasan pemilihan panjang gelombang tersebut karena merupakan panjang gelombang dilakukannya uji efikasi yang masuk dalam range UV mengiritasi kulit. Selain itu karena lampu UV yang digunakan untuk pengukuran in vivo hanya memancarkan panjang gelombang 365 nm.
Ta be l V I I I . H a sil pe n gu k u r a n SPF Serapan (A) SPF Replikasi Replikasi Σ beta karoten (mg) 1 2 3 1 2 3 SPF rata-rata 1,64043 1,152 1,038 1,028 14,191 10,914 10,666 11,924
Perhitungan filtrat yang diperlukan dalam formula
Ta be l I X . H a sil pe n gu k u r a n SPF filt r a t pe r a sa n w or t e l
Konsentrasi (ppm) Serapan SPF Rata-rata SPF 0,919 8,299 0,985 9,661 52,493736 0,904 8,017 8,659 1,152 14,191 1,038 10,914 65,61717 1,028 10,666 11,924
Dari perhitungan diketahui bahwa untuk mendapatkan nilai SPF 11,92 maka kadar beta karoten dalam sediaan adalah 65,61717 ppm. Absorbansi yang mendekati nilai SPF yang diharapkan diperoleh dari endapan perasan wortel, maka kadar beta karoten filtrat disesuaikan untuk mencapai kadar beta karoten yang setara dengan kadar beta karoten pada endapan perasan wortel. Dari hasil perhitungan diperoleh jumlah filtrat perasan yang diperlukan untuk menghasilkan SPF 11,924 adalah 99,2968 gram, apabila diinginkan untuk membuat 200 gram
gel. Formula yang dibuat sesuai perhitungan menghasilkan sediaan gel yang berpenampilan buruk yaitu warna gel yang terlalu orange pekat seperti saos tomat, mungkin karena jumlah filtratnya terlalu banyak sehingga konsentrasi filtrat dalam sediaan gel menjadi terlalu pekat.
Penampilan fisis yang demikian jelas tidak bisa diterima oleh masyarakat, oleh karenanya diperlukan sebuah cara untuk dapat menghasilkan gel yang memiliki penampilan yang lebih bisa diterima masyarakat secara luas. Langkah yang diambil adalah mengurangi konsentrasi filtrat perasan wortel dalam pembuatan formula yang baru, setelah dicoba membuat gel dengan filtrat perasan wortel sejumlah 3,5 gram dalam 100 gram formula memberikan hasil sediaan gel dengan penampilan yang menarik (acceptable).
2. Penetapan kadar beta karoten dan nilai SPF dalam sediaan gel
Panjang gelombang serapan maksimum yang diperoleh adalah 452,2 nm. Dapat dilihat pada gambar di bawah ini:
Ga m ba r 1 0 . H a sil sca n n in g pa n j a n g ge lom ba n g se r a pa n m a k sim u m la r u t a n be t a k a r ot e n 4 5 2 ,2 n m
Ta be l X . Ku r v a ba k u be t a k a r ot e n de n ga n Pe r k in - Elm e r
Spe k t r ofot om e r UV - V is La m bda 2 0
KURVA BAKU I KURVA BAKU II KURVA BAKU III Kadar (ppm) Absorbansi Kadar (ppm) Absorbansi Kadar (ppm) Absorbansi 2,060 0,341 2,114 0,276 2,182 0,361 4,120 0,669 4,228 0,543 4,364 0,676 6,180 0,980 6,342 0,922 6,546 1,046 8,240 1,320 8,456 1,182 8,728 1,232 10,300 1,656 10,57 1,462 10,91 1,658 A = 0,00890 B = 0,15927 r = 0,99988 y = 0,15927 x + 0,00890 A = – 0,02630 B = 0,14240 r = 0,99812 y = 0,14240 x – 0,02630 A = 0,04960 B = 0,14436 r = 0,99510 y = 0,14436 x + 0,04960
Dari hasil perhitungan kadar dan absorbansi ketiga seri larutan baku diatas menggunakan metode regresi linear, didapatkan 3 persamaan dengan nilai r (regresi) yang berbeda. Ketiga persamaan tersebut memiliki nilai r yang lebih besar dari pada nilai r tabel (r tabel = 0,878) dengan taraf kepercayaan sebesar 95 %, sehingga didapatkan kesimpulan bahwa ketiga persamaan tersebut linear.
Berdasarkan nilai r dari ketiga seri larutan baku tersebut, didapati bahwa pada seri larutan baku I memiliki nilai r yang paling mendekati 1, yaitu sebesar 0,99988. Semakin tinggi nilai regresi menunjukkan semakin baik hubungan sebab akibat antara variabel bebas dan variabel tergantung, dalam penetapan kadar ini hubungan yang dimaksud adalah bahwa perubahan nilai kadar benar-benar mempengaruhi nilai absorbansi yang didapat. Sehingga untuk perhitungan kadar digunakan persamaan y = 0,15927x – 0,00890. Sebagai catatan perlu diketahui bahwa setiap kali membuat sediaan gel perlu dilakukan penetapan kadar beta karoten terlebih dahulu, tujuannya adalah untuk menentukan jumlah filtrat perasan wortel yang akan digunakan dalam pembuatan sediaan gel. Hal ini dilakukan
karena sangat besar kemungkinan adanya perbedaan kadar beta karoten dalam wortel yang berbeda. Hasil dari pengukuran nilai absorbansi sampel adalah sebagai berikut :
Ta be l X I . Ju m la h be t a k a r ot e n da la m 1 gr a m filt r a t pe r a sa n w or t e l de n ga n Pe r k in - Elm e r Spe k t r ofot om e r UV - V is La m bda 2 0
filtrat absorbansi Σ beta karoten dalam 1 g filtrat x ± SD (mg) CV(%) 1 1,067 0,08304 2 1,056 0,08218 3 1,059 0,08241 0,08254 ± 0,00045 0,5392
Dari perhitungan diperoleh jumlah beta karoten dalam 200 gram sediaan adalah 0,29 mg, memberikan nilai SPF sebesar 1,12.
Tabel XII. Hasil pengukuran SPF dalam 200 gram gel
Serapan (A) SPF Replikasi Replikasi Σ beta karoten 1 2 3 1 2 3 SPF rata-rata 0,28889 mg 0,080 0,029 0,032 1,2023 1,0691 1,0765 1,1159
Berdasarkan tabel di atas dapat diketahui bahwa ternyata hasil nilai SPF in vitro dari sediaan sangatlah kecil, yaitu hasil rata-rata dari 3 replikasi hanya sebesar 1,12 saja.Jika suatu sediaan memiliki nilai SPF lebih dari 2 maka masih dapat digolongkan menjadi sediaan sunscreen, sehingga dapat dikatakan sediaan ini tidak memenuhi syarat untuk dapat disebut sebagai sediaan sunscreen. Walau demikian sediaan ini masih berpotensi sebagai sediaan UV protection karena masih dapat memberikan perlindungan terhadap radiasi UV (perlindungan terhadap radiasi UV tersebut ditunjukkan dengan sediaan tersebut memiliki nilai SPF) dengan mekanisme mencegah terjadinya resiko photoaging karena sifatnya sebagai antioksidan. Jadi mekanisme perlindungan beta karoten dalam wortel
bukan dengan mengabsorpsi atau merefleksikan sinar UV tetapi dengan menangkap radikal bebas yang dilepaskan sel akibat paparan radiasi UV. Dengan dasar demikian maka sediaan yang dibuat adalah sediaan UV protection.
