BAHAN DAN METODE
8. Perhitungan finansial industri xilanase
Metode Penelitian
Isolasi, Seleksi Dan Identifikasi Bakteri Penghasil Xilanase
Seleksi bakteri dilakukan dengan mengambil contoh tanah dari pembuangan limbah tapioka ‘Setia’ Kedunghalang Bogor, daerah berkapur Purworejo dan Boyolali Jawa Tengah, dan tanah berkapur Ciampea Bogor Jawa Barat. Tanah diambil secara aseptik dan dimasukkan ke dalam kantong plastik steril dan disimpan sampai siap digunakan.
Isolasi bakteri dari contoh tanah dilakukan dengan mengacu pada penelitian
Nakamura et al (1993) yaitu komposisi media cair untuk satu liter adalah 0,1 g
ekstrak khamir, 0,5 g polipepton, 0,1 g K2HPO4, 0,02 g MgSO4 7H2O dan 0,1 g oat spelt xylan (Sigma). Media diatur pada pH 9,5 dengan penambahan Na2CO3 1%. Konsentrasi inokulan yang digunakan sebanyak 10%. Inkubasi dilakukan pada agitasi 150 rpm suhu 30 - 380C selama 3 hari. Seleksi dilakukan secara bertahap berdasarkan zona bening yang dihasilkan disekeliling koloni pada media padat di petridish yang bersifat alkali. Tahapan ini merupakan langkah awal untuk mengetahui apakah isolat tersebut dapat mendegradasi substrat (xilan) pada media pertumbuhannya. Apabila mampu mendegradasi dengan terbentuknya zona bening disekeliling koloni maka isolat dinyatakan menghasilkan xilanase. Pada tahap ini seleksi untuk masing- masing isolat dilakukan ulangan sebanyak tiga kali.
Pengujian selanjutnya dilakukan dengan cara menumbuhkan koloni bakteri dari masing- masing isolat pada media cair. Hal ini dimaksudkan untuk mengetahui seberapa jauh kemampuan isolat bakteri dalam menghasilkan xilanase. Media cair dengan komposisi sama dengan media untuk isolasi, sebanyak 50 ml dalam erlemeyer. Setelah pemanenan, dilakukan beberapa pengamatan, yaitu biomasa, protein terlarut dan aktivitas xilanase.
Analisis statistik yang digunakan pada tahap ini adalah rancangan acak lengkap dengan perlakuan 5 isolat bakteri dan C. acetobutylicum ATCC 769 sebagai kontrol dengan 4 kali ulangan. Dari percobaan ini diambil satu isolat unggul.
Tanah
Isolasi pada media yang diperkaya
Koloni berzona bening
Pembiakan pada media cair (NB 5 ml)
Propagasi pada media cair (media untuk xilanase 50 ml)
Seleksi :
• Biomasa
• Protein terlarut
• Aktivitas xilanase
Isolat terpilih
Seleksi tahap II menggunakan isolat C. acetobutylicum ATCC 769
sebagai kontrol
Isolat potensial
Identifikasi Isolat potensial
teridentifikasi
Gambar 3 Diagram alir tahapan kerja isolasi dan seleksi isolat bakteri unggul penghasil xilanase.
Parameter yang diukur yaitu biomassa dengan mengukur kerapatan optik pada panjang gelombang 660 nm menggunakan spektrofotometer. Protein terlarut diukur dengan metode Bradford (1976). Aktivitas xilanase diukur dengan uji kemampuan enzim menghidrolisis xilan menjadi gula reduksi menurut Winterhalter and Liebl (1995). Analisis gula reduksi dilakukan dengan pereaksi DNS (3,5 asam dinitro salisilat) dan berdasarkan serapannya pada panjang gelombang 550 nm. Sebagai standar digunakan deret larutan standar xilosa. Satu unit aktivitas xilanase adalah jumlah enzim yang dapat menghasilkan gula reduksi (xilosa) sebanyak 1 µ mol/menit (Kubata et al., 1992).
Identifikasi Bakteri Unggul Penghasil Xilanase
Identifikasi dilakukan untuk isolat unggul penghasil xilanase. Pencirian isolat berdasarkan sifat fisiologi, yaitu morfologi koloni dan pewarnaan Gram. Kemudian uji biokimia meliputi uji katalase, uji Voges-Proskaeur (VP) dan methyl red (MR), uji urease, nitrat dan kemampuan memecah pati. Selanjutnya berdasarkan hasil uji terhadap mikroorganisme tersebut dapat diketahui spesies mikroorganisme dengan menggunakan metode Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, dalam Buchanan dan Gibbons (1984). Untuk mendukung hasil identifikasi menggunakan medium sintetik maka dilakukan identifikasi berdasarkan pada sekuen 16S ribosomal RNA.
Formulasi Media Kultivasi Produksi Xilanase Dengan Media Bersubstrat Oat
Spelt Xylan.
Formulasi media dilakukan dengan cara meragamkan komposisi media untuk pertumbuhan bakteri penghasil xilanase. Rancangan penelitian yang dilakukan yaitu Rancangan Acak Faktorial dengan tiga faktorial. Ulangan dilakukan tiga kali. Sebagai faktor I adalah oat spelt xylan (0,5; 0,75; 1,0). Faktor II adalah pepton (0; 0,1; 0,3; 0,5%), dan faktor III perlakuan ekstrak khamir (0,1; 0,2; 0,3%). Kultivasi dilakukan di dalam labu erlemeyer 100 ml menggunakan konsentrasi inokulum 10%. Isolat bakteri terpilih diuji kemampuannya menghidrolisis oat spelt xylan tersebut, dengan mengukur aktivitas xilanase dan kandungan protein terlarut. Contoh dipanen sesudah 3 hari inkubasi, kemudian diukur protein terlarut dengan metode Bradford (1976) dan aktivitas enzim xilanase menurut Winterhalter dan Liebl (1995).
Ekstraksi Xilan Dari Tongkol Jagung
Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu tahap awal adalah analisis proksimat bahan baku meliputi kadar air, abu dan serat (AOAC, 1984). Tahap selanjutnya adalah ekstraksi xilan mengacu pada metode dari Yoshida et al.(1994) tentang ekstrak xilan dari biji kapas, kemudian dimodifikasi (Gambar 4). Modifikasi metode dengan menentukan konsentrasi NaOCl pada proses delignifikasi dan perbandingan supernatan dan etanol (v/v) yang tepat untuk ekstraksi xilan, selanjutnya uji kelarutan, uji kualitatif dan kuantitatif xilan yang diperoleh dari ekstraksi tersebut.
Tongkol jagung kering digiling sampai lolos saringan ukuran 40 mesh. Contoh sebanyak 50 g dimasukkan ke dalam wadah plastik kemudian direndam dalam larutan NaOCI dengan konsentrasi 0,5; 1; 2,5; 5 dan 7,5% selama 5 jam pada suhu 28oC (proses delignifikasi). Setelah 5 jam contoh dibilas dengan air dan disaring. Selanjutnya padatan yang dihasilkan direndam dalam larutan NaOH 10% selama 24 jam pada suhu 28oC. Perendaman ini bertujuan untuk mengekstraksi xilan. Setelah 24 jam, dilakukan penyaringan. Filtrat yang dihasilkan ditampung untuk diukur pH-nya dan selanjutpH-nya dinetralkan dengan menggunakan HCI 6N, selanjutpH-nya disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan putaran 4000 rpm. Supernatan yang dihasilkan dari sentrifugasi mengandung xilan.
Xilan yang larut dalam air dapat dipisahkan dengan menambahkan etanol 95%. Etanol ditambahkan pada supernatan dengan perbandingan supernatan-etanol adalah 1:1, 1:2, 1:3 dan 1:4. Perbandingan ini dimaksudkan untuk mengetahui pada rasio berapa jumlah xilan dapat dihasilkan secara optimal. Diagram alir ekstraksi xilan dari tongkol jagung disajikan pada Gambar 4. Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial 5x4 dengan dua kali ulangan. Pengamatan yang dilakukan adalah rendemen xilan.
Kelarutan xilan diuji dengan melarutkan xilan dalam pelarut alkali (NaOH 1%, HCl 1N, etanol, air panas dan air dingin. Kelarutan suatu senyawa menunjukkan seberapa jauh senyawa tersebut dapat larut dalam suatu pelarut. Analisis kualitatif dan kuantitatif xilan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan
mengukur retention time. Instrumen yang digunakan yaitu KCKT Shimadzu C-R3A,
jenis kolom C18, fase gerak air, detektor refraktif indeks dengan kecepatan alir 0,8 ml/menit.
Tepung Tongkol Jagung
Perendaman dalam NaOCl (5 jam, suhu 28oC Pencucian Sentrifugasi (4000 rpm, 30 menit) Pengeringan (suhu 35oC, 24 jam) Perendam di NaOH 10% (suhu 28oC, 24 jam) Sentrifugasi (4000 rpm, 30 menit) Lignin Endapan Supernatan Penetralan dengan HCl 6N Sentrifugasi (4000 rpm, 30 menit) Endapan Supernatan Etanol 95% Sentrifugasi (4000 rpm, 30 menit) Xilan
Keterangan : Metode mengacu pada Yoshida, et al. (1994) yang dimodifikasi pada penambahan
konsentrasi NaOCl dan etanol.
Gambar 4 Diagram alir ektraksi xilan dari tongkol jagung
Formulasi media kultivasi produksi xilanase de ngan media bersubstrat xilan dari tongkol jagung.
Formulasi media untuk pertumbuhan RXAIII-5 dibuat dengan memanfaatkan hasil ekstraksi xilan dari tongkol jagung sebagai sumber karbon. Disamping itu juga
dikaji pengaruh pepton dan ekstrak khamir sebagai sumber nitrogen, dan K2HPO4
sebagai sumber mineral. Kultivasi dilakukan di dalam labu erlemeyer 100 ml menggunakan konsentrasi inokulan 10%.
Komposisi media pertumbuhan bakteri sama dengan tahapan sebelumnya dengan beberapa perlakuan konsentrasi xilan tongkol jagung, pepton, ekstrak khamir dan K2HPO4. Matrik perlakuan disajikan pada Lampiran 10. Contoh dipanen sesudah 3 hari inkubasi, kemudian diukur biomassanya dengan pengukuran kerapatan optik pada panjang gelombang 660 nm, protein terlarut diukur dengan metode Bradford (1976) dan aktivitas enzim xilanase menurut Winterhalter dan Liebl (1995).
Rancangan untuk formulasi media dilakukan dengan Respon Surface
Methodology. Empat variabel yang akan dioptimasi ialah polipepton (X1), ekstrak khamir (X2), xilan (X3), dan mineral (X4). Matrik perlakuan disajikan pada Lampiran 10.
Y1 = b0 + b1 X ii + b2 X 2i + b3 X 3i + b4 X 4i + b11 X 1i2 + b22 X 2i + b33 X 3i2 + b44 X 4i2 + b12 X 1i X 2i + b13 X 1i X 3i + b14 X 1i X 4i
+ b23 X2i X 3i + b24 X 2i X 3i + b34 X 3i X 4i + ri
Optimasi Kondisi Proses
Kondisi optimum proses meliputi pH dan suhu dilakukan pada skala 50 ml kemudian dilanjutkan aerasi dan agitasi pada bioreaktor 2l.
1. Penentuan optimasi proses pH dan suhu.
Kajian pengaruh pH dan suhu terhadap laju pertumbuhan bakteri RXAIII-5. Interval untuk suhu (X1) 35 - 550C sedangkan pH (X2) 7 - 11, dan kecepatan shaker (X3)100 sampai 140 rpm.
Kultivasi dilakukan di dalam labu erlemeyer 100 ml menggunakan konsentrasi inokulan 10%. Komposisi media pertumbuhan bakteri berdasarkan hasil tahapan formulasi media bersubstrat xilan tongkol jagung.
Rancangan percobaan untuk optimasi kondisi kultivasi dilakukan dengan
perlakuan disajikan pada Lampiran 11. Pengamatan dilakukan terhadap biomassa, aktivitas xilanase, kandungan protein terlarut dan substrat tersisa.
2. Optimasi proses untuk aerasi dan agitasi
Kajian optimasi proses untuk aerasi dan agitasi dilakukan dengan memproduksi enzim xilanase dalam bioreaktor. Media yang digunakan sebanyak satu liter dilakukan pada pH dan suhu hasil optimasi 50 ml. Pada penelitian tahap ini kecepatan agitasi dilakukan pada 100, 150 dan 200 rpm. Laju aerasi dilakukan pada 0.5 dan 1.0 vvm (volume udara per volume media per menit). Proses dijalankan secara terkendali dengan penambahan NaOH maupun HCl untuk
pengatur pH dan silicone antifoaming agent sebagai antibuih yang
penambahannya dilakukan secara automatik. Pemanenan hasil kultivasi dilakukan pada jam ke-0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 32, 36, 40, 44, dan 48. Hasil panen disentrifus (kecepatan 4000 rpm) untuk memisahkan massa sel dengan supernatan yang akan dianalisis. Pengamatan meliputi biomassa, aktivitas enzim dan kandungan protein terlarut.
Kinetika Kultivasi Dalam Bioreaktor Biostat-B-2l
Kombinasi laju aerasi dan kecepatan agitasi tersebut digunakan dalam perhitungan parameter kinetika.Pada tahap ini akan dikembangkan model matematika untuk menjelaskan dinamika sistem yang meliputi perubahan sel, substrat, produk selama kultivasi. Model yang digunakan adalah model yang dikembangkan oleh Monod (1949).Kerangka model matematika adalah sebagai berikut:
dx/dt = µ x (untuk biomasa) µ = µmaks .S/(Ks + S) atau 1/µ = (Ks/µmaks)(1/S) +1/µmaks
Yp/s = -dP/dS (efisiensi penggunaan substrat untuk membentuk produk ensim) Yp/x = dP/dX (efisiensi sel dalam menghasilkan produk)
Yx/s = -dX/dS (efisiensi penggunaan substrat untuk produksi sel)
X : Konsentrasi sel (g/L), S : Konsentrasi substrat (g/L)
P : Konsentrasi produk t : Waktu kultivasi (jam)
µ: laju pertumbuhan spesifik (l/jam) ks : konstanta (g/L) µmaks: laju pertumbuhan spesifik maksimum (l/jam)
Parameter kinetik yang meliputi µmaks, Yp/s, Yx/s, Yp/x ditentukan dari data percobaan menggunakan teknik regresi linear, yaitu µmaks merupakan kemiringan kurva dari hubungan ln bobot kering dan waktu, Yp/s, Yx/s, dan Yp/x berturut-turut merupakan kemiringan kurva dari hubungan perubahan produk (enzim) dan substrat, biomassa dan substrat serta produk dan biomasa.
Sifat Reologi Cairan Kultivasi
Penentuan densitas cairan kultivasi dilakukan dengan alat piknometer, yaitu pembagian bobot cairan kultivasi dengan volumenya. Viskositas dihitung dengan alat
Brookfield Viscometer pada kecepatan putar 6,12, 30, 60 rpm menggunakan spindle
nomor 2. Dari data tersebut diperoleh laju geser, viskositas dan tegangan geser, sehingga diperoleh nilai k= Indeks konsistensi dan nilai n= Indeks perilaku cairan.
Bilangan Reynolds (NRe) ditentukan dengan persamaan NRe = (N1 D12 ?) / µa
Dimana : N1 : kecepatan pengadukan, D1 : Diameter pengaduk, ?: Densitas , µa : Viskositas, k : Indeks konsistensi, n : Indeks perilaku cairan
Berdasarkan data tersebut dan data dari bioreaktor Model Biostat-2l, maka dapat
ditentukan konsumsi tenaga impeller. Menurut Wang et al (1979) konsumsi tenaga
yang dibutuhkan ditentukan dengan persamaan: P = (? N3 D15 Np ) /gc
Dimana: P = tenaga yang dibutuhkan, Np = Bilangan power, gc = Grafitasi = 9,81
cm/det2. Dasar-dasar untuk penggandaan skala ditentukan berdasarkan tenaga per unit volume.
Karakterisasi Enzim Xilanase Dari Isolat Bakteri Terpilih
Sebelum karakterisasi xilanase dilakukan pengendapan terlebih dahulu. Hasil pengendapan yaitu enzim kasar dilakukan karakterisasi meliputi stabilitas xilanase pada pH dan suhu optimum, Km dan Vmaks, inhibisi dan aktivasi enzim. Disamping itu terhadap hasil pengendapan yang beraktivitas xilanase tertinggi dilakukan pemurnian.
Pengendapan Enzim
Produksi xilanase dari isolat bakteri terpilih dilakukan pada media cair dengan komposisi berdasarkan hasil tahapan sebelumnya. Fermentasi dihentikan setelah 48
jam dan dilanjutkan dengan pemisahan biomasa bakteri dari cairan kultivasi (broth). Semua tahapan dilakukan pada kondisi suhu 4oC.
Supernatan (100 ml) hasil kultivasi yang telah dipisahkan dari biomasa, kemudian diendapkan. Perlakuan pengendapan menggunakan: 1) Amonium sulfat 80
% jenuh, 2). Aseton dan 3). Etanol (-20oC) dengan perbandingan 1:2. lalu
disentrifugasi 4000 rpm selama 15 menit. Diagram alir perlakuan disajikan pada Gambar 5.
Pemurnian enzim
Pemurnian enzim dilakukan pada enzim kasar dari hasil pengendapan dengan amonium sulfat. Endapan didialisis menggunakan bufer fosfat 50 mM, pada pH 7 selama 15 jam (Lin et al. 1999). Hasil dialisis dimurnikan menggunakan alat
preparative electrophoresis (Prepcell) 491 Biorad. Pemurnian ini berdasarkan Produksi enzim (1500 ml)
pada kondisi optimum
Sentrifugasi 4000 rpm 30 menit 4oC
Supernatan Endapan
(biomasa)
Presipitasi (penamb ahan amonium
sulfat )
Enzim kasar
Gambar 5 Diagram alir pengendapan enzim xilanase. Presipitasi
(penambahan etanol)
Presipitasi (penambahan aseton)
elektroforesis. Native-PAGE (non SDS_PAGE) digunakan untuk menghilangkan protein kontaminan. Pemurnian dalam gel dengan alat ini memerlukan waktu 8 jam, dengan arus sebesar 40 mA (12 watt constant power). Hasil pemurnian berupa fraksi xilanase dikumpulkan dengan fraction collector.Setiap fraksi diuji aktivitas enzimnya didasarkan pada kemampuan xilanase pada fraksi tersebut dalam menghidrolisis xilan.
Pene ntuan Aktivitas dan Stabilitas Enzim Pada pH Dan Suhu Optimum
Penentuan aktivitas dan stabilitas xilanase pada pH dan suhu optimum
dilakukan menurut Ratakhanokchai et al. (1999). Penentuan aktivitas pada pH
optimum dilakukan dengan mengukur aktivitas enzim kasar pada berbagai kondisi pH. Kondisi pH katalitik optimum didapat dengan melarutkan enzim dalam bufer fosfat-sitrat pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 dan 9,0, dengan masa inkubasi 30 menit dan
suhu 50 oC. Pengenceran juga dilakukan dengan bufer pH yang sama. Untuk
mengetahui pengaruh pH terhadap stabilitas xilanase, enzim tersebut diinkubasi pada bufer pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 dan 9,0 dengan suhu 4oC selama 0, 18, dan 24 jam.
Penentuan aktivitas pada suhu reaksi optimum, dilakukan dengan mengukur aktivitas enzim pada berbagai suhu reaksi, yaitu 30oC, 40oC, 50oC, 60oC, dan 70oC dengan masa inkubasi 30 menit dan pH reaksi 7,0. Sedangkan pengaruh suhu terhadap stabilitas xilanase diuji dengan menginkubasi enzim pada suhu 40 oC, 50 oC, 60 oC, dan 70 oC selama 5, 10, dan 15 menit. Aktivitas sisa xilanase diukur dengan metode standar.
Penentuan Kmdan Vmaks
Nilai Vmaks dan Km dari xilanase diperoleh dari uji hidrolisis dengan substrat xilan pada interval konsentrasi 0% - 2% (b/v). Xilosa yang terbentuk diukur dengan metode pengukuran aktivitas standar. Penentuan nilai Vmaks dan Km ini dilakukan terhadap enzim kasar berdasarkan grafik Lineweaver-Burk (Tucker and Wood. 1995).
Pengaruh Inhibitor dan Aktivator
Pengaruh logam terhadap aktivitas enzim dilakukan dengan menginkubasi cairan enzim kasar dengan ion logam dan senyawa lain pada konsentrasi akhir 0,1 - 10 mM. Ion logam berat yang dicobakan adalah Co2+, Cu2+, Fe3+, Mn2+, Ag2+, dan ion Zn2+, Mg2+,Ca2+, Na+, pada konsentrasi 2,0 mM, 4,0 mM dan 10,0 mM dalam persenyawaan garamnya. Sedangkan untuk EDTA konsentrasinya ditetapkan 0,1
mM, 0,2 mM, dan 0,5 mM. Pada penelitian juga diperiksa pengaruh hasil hidrolisis oleh enzim yang berupa gula-gula reduksi. Senyawa yang dimaksud adalah glukosa, maltosa dan sukrosa yang ditetapkan konsentrasinya sebesar 2 mM, 4mM, dan 10 mM.
Inkubasi dilakukan selama 30 menit pada suhu 50oC dan aktivitas enzim
diukur dalam kondisi standar. Tingkat inhibisi/aktivasi relatif ditentukan dengan perbandingan dalam persen antara aktivitasnya dengan inhibitor/aktivator terhadap aktivitas enzim tanpa inhibitor/aktivator.
Kemampuan Enzim Xilanase Untuk Mendegradasi Xilan
Untuk mengetahui kemampuan xilanase mendegradasi xilan, maka xilan dari tongkol jagung sebanyak 1g dalam 5 ml bufer fosfat pH 9 ditambah cairan enzim
kasar (1ml) kemudian diinkubasi pada suhu 50oC selama 16 jam (Kulkarni et al.
1995). Hasil hidrolisis diukur menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Shimadzu C-R3A dengan jenis kolom C 18, fase gerak air, detektor refraktif indeks (RI) dengan kecepatan alir 1 ml/menit.
Kemampuan enzim kasar mendegradasi substrat spesifik
Untuk mengetahui kemampuan enzim kasar mendegradasi beberapa substrat
spesifik dilakukan dengan menginkubasi enzim kasar dengan substratnya yaitu oat
spelt xylan, xilan tongkol jagung, carboxymethyl cellulose (CMC) dan avicel. Sebanyak 1 ml enzim kasar ditambahkan 5 ml larutan substrat (1 g) diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC pH 9 (Dung et al. 1993).