3. METODE PENELITIAN
4.2 Perubahan Histopatologis Usus
Saluran pencernaan, termasuk usus, merupakan tempat utama rangsangan antigen pada hewan. Usus dapat menjadi barier sekaligus jalur masuk bahan toksik dan karsinogenik ke dalam tubuh yang masuk melalui rute per oral (Schackelford dan Elwell 1999). Partikel antigen seperti bakteri dapat dengan mudah menembus mukosa usus dan melalui cara ini masuk ke pembuluh laktil dan pembuluh porta (Tizard 1987).
Infeksi bakteri patogen dapat menyebabkan inflamasi usus (enteritis) yang ditandai dengan (1) infiltrasi sel radang, (2) deskuamasi epitel usus (3) udema pada lamina propria, (4) kongesti arteri pada lapisan superfisial, (5) dilatasi jaringan Peyer’s patches, (6) hemoragi, dan (7) ditemukannya perlekatan bakteri pada batas mikrovili usus (Barker et al. 1993). Pada penelitian ini, paramater pengamatan histopatologi usus yang digunakan untuk menentukan ada tidaknya peradangan akibat infeksi E. sakazakii terdiri atas deskuamasi epitel usus, udema pada lamina propria, dan jumlah sel radang.
4.2.1 Deskuamasi Epitel dan Udema Lamina Propria
Deskuamasi epitel merupakan kejadian lepasnya sel epitel dari permukaan jaringan. Menurut Barker et al. (1993), deskuamasi epitel merupakan salah satu tanda umum inflamasi usus. Selain akibat kondisi patologis, secara fisiologis tubuh akan meregenerasi epitel usus setiap 5-7 hari (Price dan Wilson 1995). Pengamatan histopatologis pada penelitian ini dilakukan 3 hari post infeksi sehingga tubuh belum sempat meregenerasi epitel yang mengalami deskuamasi. Infeksi bakteri dapat menyebabkan terjadinya enteritis hemoragika yang antara lain ditandai dengan deskuamasi epitel dalam jumlah banyak (Barker et al. 1993). Hasil pengamatan skoring deskuamasi epitel dapat dilihat pada Tabel 6.
Tabel 6 Rataan jumlah skoring berdasarkan peringkat dengan uji Kruskal-Wallis untuk deskuamasi epitel pada usus halus dan usus besar mencit neonatus akibat infeksi E. sakazakii dengan berbagai dosis infeksi secara per oral Kelompok Dosis Infeksi Usus Halus Usus Besar
Kontrol NaCl fisiologis 4 11
I 103 cfu/ml 9.4 11
II 104 cfu/ml 15 11
III 105 cfu/ml 15.4 11
IV 106 cfu/ml 20.2 11
V 107 cfu/ml 26 15.6
Kelompok kontrol tidak memperlihatkan deskuamasi epitel usus halus maupun usus besar, lamina propria tidak berisi banyak sel radang, dan kripta masih padat dan normal (Gambar 13). Sedangkan infeksi E. sakazakii pada mencit neonatus menyebabkan deskuamasi epitel usus halus dan usus besar, udema pada lamina propria terutama di bawah membran basal epitel usus, dan penebalan kripta (Gambar 14).
Derajat keparahan deskuamasi epitel akibat infeksi E. sakazakii di usus halus lebih parah dibandingkan usus besar. Menurut analisis statistik non parametrik dengan uji Kruskal-Wallis, terdapat perbedaan nyata (P<0,05) skoring deskuamasi epitel usus halus antara kelompok kontrol dengan kelompok yang diinfeksikan E. sakazakii. Sedangkan pada usus besar, skoring deskuamasi epitel tidak menunjukkan perbedaan yang nyata (P>0,05). Dengan demikian, usus halus lebih peka terhadap E. sakazakii dan/atau toksinnya dibandingkan dengan usus besar. Semakin besar dosis infeksi, semakin banyak deskuamasi epitel usus halus yang terjadi. Dekuamasi epitel usus besar hanya terjadi pada kelompok V yang diinfeksikan E. sakazakii dengan dosis tertinggi yaitu 107 cfu/ml.
Selain deskuamasi epitel, terjadi udema di lamina propria walaupun pada beberapa vili usus deskuamasi epitel belum terjadi. Menurut Shackelford dan Elwell (1999), pada inflamasi akut di usus terjadi udema di lamina propia. Usus yang mengalami deskuamasi epitel dan udema lamina propria menjadi rapuh dan hal ini merupakan awal enteritis nekrotikan. Mencit neonatus yang diinfeksikan 107 cfu/ml E. sakazakii mengalami enteritis nekrotikan yang ditandai dengan nekrose sel-sel di tunika mukosa dan infiltasi sel radang terutama di lamina propria (Gambar 14). Epitel berperan sebagai pelindung mukosa usus sehingga
bila telah terjadi deskuamasi epitel maka usus akan mudah diinfeksi mikroorganisme.
Gambar 13 Usus halus (kiri) dan usus besar (kanan) mencit neonatus kontrol.
Keterangan: (l) lumen usus, (e) epitel utuh, (lp) lamina propria, (k) kripta, tunika muskularis (tm). Pewarnaan HE. Pembesaran 200x.
Gambar 14 Usus halus mencit neonatus yang diberi E. sakazakii dengan dosis infeksi 107 cfu/ml.
Keterangan: (de) deskuamasi epitel, (PMN) infiltrasi sel radang polimorfo nuklear neutrofil di lamina propria, (u) udema lamina propria, (N) enteritis nekrotikan, (tm) tunika muskularis. Pewarnaan HE. Pembesaran 200x.
4.2.2 Sel Radang
Menurut Shackelford dan Elwell (1999), pada inflamasi akut terjadi infiltrasi leukosit dalam jumlah yang ringan dan didominasi oleh sel polimorfo nuklear (PMN) neutrofil. Dengan demikian, sel radang merupakan indikator terjadinya inflamasi usus. Jumlah sel radang pada usus halus dan usus besar mencit neonatus akibat infeksi E. sakazakii dengan berbagai dosis infeksi secara per oral disajikan pada Tabel 7 dan Gambar 15. Pengamatan tidak dilakukan pada setiap lapisan usus karena lapisan usus mencit neonatus belum berkembang secara sempurna sehingga sulit untuk dibedakan.
Tabel 7 Rataan jumlah sel radang pada usus halus dan usus besar mencit neonatus akibat infeksi E. sakazakii dengan berbagai dosis infeksi secara per oral Kelompok Dosis Infeksi Usus Halus Usus Besar
Kontrol NaCl fisiologis 14,12 ± 1,33a*) 16,29 ± 2,95a I 103 cfu/ml 24,92 ± 2,59ab 16,28 ± 2,10a II 104 cfu/ml 29,70 ± 2,57bc 17,75 ± 1,90a III 105 cfu/ml 31,15 ± 3,73bc 18,92 ± 2,92a IV 106 cfu/ml 40,44 ± 11,97cd 22,40 ± 2,25a V 107 cfu/ml 50,84 ± 16,83d 33,32 ± 19,29b
*) Superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata (P<0,05).
Gambar 15 Grafik rataan jumlah sel radang pada usus halus dan usus besar mencit neonatus akibat infeksi E. sakazakii dengan berbagai dosis infeksi secara per oral.
Berdasarkan Tabel 7 diketahui bahwa terdapat perbedaan nyata (P<0,05) jumlah sel radang pada usus halus mencit neonatus yang diberi perlakuan dibandingkan dengan kontrol. Sel radang juga ditemukan pada mencit kontrol
karena secara fisiologis memang terdapat sel radang di usus, misalnya di tunika mukosa dan tunika submukosa (Shackelford dan Elwell 1999) (Gambar 13). Jenis sel radang yang dihitung melalui pengamatan preparat histopatologi pada penelitian ini terdiri atas limfosit, makrofag, neutrofil, eosinofil, dan basofil.
Berdasarkan hasil pengamatan, sel radang pada mencit yang mati dalam tiga hari paska infeksi didominasi neutrofil. Sedangkan pada mencit yang bertahan hidup sel radang didominasi limfosit. Menurut Barker et al. (1993), neutrofil ditemukan pada inflamasi akut akibat infeksi bakteri sedangkan limfosit ditemukan pada inflamasi kronis. Dengan demikian, mencit yang mati mengalami inflamasi akut sedangkan mencit yang tidak mati mengalami inflamasi kronis.
Pada hewan yang diberi perlakuan, jumlah sel radang di usus halus lebih banyak dibandingkan dengan di usus besar. Hal ini menunjukkan bahwa derajat keparahan inflamasi yang terjadi di usus halus lebih tinggi dibandingkan dengan usus besar. Iversen dan Forsythe (2003) memperkirakan dosis infeksi awal E. sakazakii sebesar 103 cfu/100 mg. Jika dibandingkan dengan kontrol, infeksi E. sakazakii dengan dosis terendah, yakni 103 cfu/ml menyebabkan peningkatan rata- rata jumlah sel radang yang tidak berbeda nyata (P>0,05). Namun, terdapat
perbedaan nyata (P<0,05) pada nilai rataan sel radang usus akibat infeksi E. sakazakii dengan dosis 104 cfu/ml dan 105 cfu/ml dengan kontrol. Data ini
menunjukkan bahwa dosis infeksi awal E. sakazakii terhadap usus halus sebesar 104 cfu/ml. Sedangkan, nilai rataan sel radang pada infeksi E. sakazakii dengan dosis 106 cfu/ml dan 107 cfu/ml sangat berbeda nyata (P<0,05) dengan kontrol maupun dosis infeksi lain yang lebih rendah. Data di atas membuktikan bahwa semakin besar dosis infeksi E. sakazakii yang digunakan, maka semakin banyak jumlah sel radang. Semakin tinggi jumlah sel radang menjadi indikator semakin parahnya inflamasi.
Rataan jumlah sel radang usus besar mencit neonatus yang diinfeksikan E. sakazakii dengan dosis 103, 104, 105, dan 106 cfu/ml tidak berbeda nyata (P>0,05) dengan kontrol. Walaupun demikian, terjadi peningkatan rata-rata jumlah sel radang berbanding lurus dengan peningkatan dosis infeksi. Peningkatan sel radang, misalnya limfosit, walaupun hanya dalam jumlah sedikit merupakan indikasi telah terjadi inflamasi (Barker et al. 1993). Berbeda dengan
pemberian E. sakazakii dengan dosis infeksi yang lebih rendah, infeksi E. sakazakii dengan dosis 107 cfu/ml berbeda nyata dengan kontrol. Dosis infeksi ini lebih rendah dibandingkan dengan dosis yang digunakan Pagotto et al. (2003). Menurut Pagotto et al. (2003), infeksi E. sakazakii pada dosis 108 cfu/ml secara intra peritoneal dan per oral dapat menyebabkan kematian mencit neonatus.
Berdasarkan pengamatan histopatologis, pada penelitian ini ditemukan peningkatan jumlah limfosit dan netrofil terutama di lumen dan tunika mukosa usus halus. Netrofil juga ditemukan di sekitar daerah yang mengalami nekrosa. Kehadiran sel radang misalnya neutrofil dalam jumlah banyak merupakan indikator terjadinya inflamasi. Namun, neutrofil tidak selalu ditemukan di mukosa usus karena biasanya masuk ke lumen usus bila ada invasi bakteri (Barker et al. 1993). Lisosom neutrofil mengandung banyak enzim lisozim yang berfungsi sebagai faktor antibakteri yang kuat pada jaringan. Lisozim mampu menghancurkan beberapa bakteri gram negatif. Akibatnya, neutrofil cenderung berkumpul di daerah perbarahan akut termasuk tempat invasi bakteri (Tizard 1987).
Deskuamasi epitel, udema lamina propria, dan infiltrasi sel radang di usus akibat E. sakazakii dan/atau toksinnya membuktikan bahwa E. sakazakii dan/atau toksinnya dapat menyebabkan enterokolitis nekrotikan. Enterokolitis nekrotikan menyebabkan gangguan absorbsi nutrisi di usus sehingga inang yang terinfeksi dapat mengalami malnutrisi.