3 METODOLOGI
3.4 Prosedur Analisis
Analisis yang dilakukan terhadap sampel bekasam ikan bandeng, terdiri dari: pengukuran kadar garam (NaCl), nilai pH dan total asam laktat. Sedangkan, uji yang dilakukan untuk mengetahui sifat morfologi dan fisiologis bakteri antara lain adalah: pengamatan bentuk sel, pewarnaan Gram dan spora, uji motilitas, katalase, oksidase, oksidatif-fermentatif Baird Parker, kualitatif Staphylococcus, koagulase, indol, reduksi nitrat, pembentukan H2S dan fermentasi glukosa dalam medium TSIA (triple sugar iron agar), pembentukan asam, penggunaan sitrat sebagai sumber energi, aktivitas proteolitik, hidrolisis lemak dan hidrolisis pati.
Sampel bekasam ikan bandeng
Dihomogenkan dengan mortar steril
10-2 10-3 10-4 90 ml
Pengenceran menggunakan Garam Fisiologis
10 10 10 10
10-1 -5 -6 -7 -8
Isolasi mikroba pada media MRSA dari tiap-tiap pengenceran
Isolasi pada media agar miring MRSA dari koloni terpilih
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7
Pemurnian dengan metode kuadran pada media MRSA
Isolat bakteri setelah dilakukan uji morfologi sel
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7
Gambar 4. Tahapan isolasi bakteri asam laktat
3.4.1 Pengukuran kadar garam (NaCl) (Apriyantono et al. 1989)
Pengukuran kadar garam dilakukan dengan menggunakan metode Mohr. Caranya adalah sebagai berikut: sampel sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam cawan porselin untuk diabukan pada suhu 600 oC selama 12 jam. Abu yang diperoleh tersebut dilarutkan dengan aquades sampai volumenya mencapai 100 ml dan kemudian disaring. Hasil dari penyaringan tersebut dipipet sebanyak 10 ml ke dalam beaker glass 50 ml, kemudian ditambahkan 3 ml K2CrO4 (kalium kromat) 5 % untuk dititrasi dengan AgNO3 (perak nitrat) 0,2 N. Titik akhir titrasi tercapai setelah terbentuk endapan perak khromat (Ag2CrO4) yang berwarna orange atau jingga. Perhitungan % NaCl adalah sebagai berikut:
% 100 contoh mg 58,4 10 AgNO N AgNO Volume NaCl % = 3× 3× × ×
Volume AgNO3 adalah jumlah perak nitrat yang dibutuhkan dalam titrasi (ml), Normalitas AgNO3 adalah 0,2 N dan faktor pengenceran sebesar 10.
3.4.2 Pengukuran nilai pH (AOAC 1995)
Sampel dalam wadah diukur pH-nya dengan menggunakan pH meter. Terlebih dahulu pH meter dinyalakan, kemudian elektroda pH-meter dimasukkan dalam buffer pH 4,31 dan 6,86. Sampel ditimbang sebanyak 1 gram, kemudian dilarutkan dalam 10 ml akuades dan dimasukkan ke dalam gelas ukur. Setelah itu elektroda dicelupkan pada larutan sampel dan dibiarkan beberapa saat sampai diperoleh pembacaan yang stabil. Nilai yang diperoleh dari hasil pembacaan pada pH meter sampai angka digital menunjukkan nilai pH tetap.
3.4.3 Total asam laktat (AOAC 1995)
Sebanyak 10 gram sampel dihancurkan dengan menggunakan mortar. Sampel yang telah homogen dilarutkan dengan akuades dalam gelas piala sampai tanda tera 100 ml. Kemudian sampel didiamkan selama 30 menit dan diaduk. Larutan yang berisi sampel tersebut disaring dan di pipet sebanyak 10 ml untuk dimasukkan ke dalam beaker glass. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 2-3 tetes fenoftalein dan dititrasi dengan NaOH 0,1 N sampai warna berubah menjadi merah muda. Persentase asam laktat yang terbentuk dihitung berdasarkan rumus:
% 100 e d c b a TA = × × × × Keterangan:
TA = Total Asam Laktat (%)
a = Jumlah NaOH yang dibutuhkan dalam titrasi (ml) b = Normalitas NaOH (0,1 N)
c = Berat equivalen asam laktat (90) d = Faktor pengenceran (10)
e = Berat sampel (mg)
3.4.4 Bentuk sel bakteri
Dari hasil isolasi bakteri yang tumbuh diamati bentuk selnya secara mikroskopik.
3.4.5 Pewarnaan Gram (Fardiaz 1989)
Secara aseptis dibuat lapisan tipis dari suspensi bakteri di atas gelas objek dan dilakukan fiksasi pada udara terbuka. Pada lapisan tipis ini ditetesi zat warna kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian dibilas dengan air kran dengan cara memegang gelas objek pada posisi miring. Sisa air yang tertinggal pada gelas objek dibuang dan ditetesi dengan lugol serta dibiarkan selama 1 menit. Setelah dicuci kembali dengan air, kemudian dihilangkan warnanya dengan menggunakan alkohol 96 % dan dibiarkan selama 10-20 detik. Setelah dicuci sebentar dengan air, kemudian diwarnai dengan safranin dan dibiarkan selama 10-20 detik. Objek gelas selanjutnya dibilas dengan air dan dikeringkan dengan kertas serap (tissue). Preparat ini diamati dibawah mikroskop dengan mengunakan lensa objektif yang telah diolesi minyak immersi. Dengan pengamatan secara mikroskopik, dapat ditentukan bentuk sel bakteri serta reaksi Gramnya. Bakteri Gram positif akan ditunjukkan dengan warna ungu, sedangkan bakteri Gram negatif akan ditandai dengan warna merah atau merah muda.
3.4.6 Pewarnaan spora (Fardiaz 1989)
Secara aseptis dibuat lapisan tipis dari suspensi bakteri di atas gelas objek dan difiksasi. Pada lapisan tipis ini ditetesi pewarna hijau malasit dan dibiarkan selama 20 menit tanpa pemanasan. Selanjutnya, preparat dibilas dengan air kran
dengan cara memegang gelas objek pada posisi miring dan dikeringkan dengan kertas serap (tissue). Setelah kering, kemudian ditambahkan beberapa tetes zat warna safranin dan dibiarkan selama 30 detik dan dicuci dengan air mengalir serta dikeringkan. Preparat ini diamati di bawah mikroskop dengan menggunakan lensa objektif yang telah diolesi minyak immersi. Dengan cara ini endospora yang masih terdapat dalam sel vegetatif maupun spora bebas akan berwarna hijau-biru, sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah sampai merah muda.
3.4.7 Uji motilitas (Fardiaz 1989)
Pengujian motilitas bakteri dilakukan dengan cara sebagai berikut: secara aseptis dengan menggunakan jarum ose yang lurus bagian ujungnya, isolat bakteri ditusukkan ke dalam nutrient broth yang mengandung agar 0,5 % (agar lunak). Inkubasi dilakukan pada suhu 35 oC selama 2 hari. Bila pertumbuhan menyebar, maka bakteri tersebut bersifat motil dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar, hanya berupa garis saja, maka bakteri tersebut bersifat non motil.
3.4.8 Uji katalase (Fardiaz 1989)
Secara aseptis diambil 1 loop isolat bakteri dan dipindahkan pada gelas objek. Preparat tersebut ditetesi dengan larutan 3 % H2O2. Adanya enzim katalase ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung seperti busa sabun.
3.4.9 Uji oksidase (Hadioetomo 1985)
Dalam uji oksidase, kultur bakteri yang akan diuji ditumbuhkan pada medium trypticase soy agar (TSA) dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1-2 hari. Koloni yang tumbuh digenangi dengan pereaksi untuk uji oksidase yaitu p-aminodimetilanilin oksalat 1 %. Uji positif ditandai dengan berubahnya koloni menjadi merah muda, merah tua, lalu merah gelap dan akhirnya hitam.
3.4.10 Uji oksidatif-fermentatif Baird Parker (Cowan dan Steel 1974)
Dalam uji oksidatif-fermentatif digunakan medium Baird Parker agar (BPA) dan indikator pH bromthymol blue. Bakteri yang akan diuji, secara aseptis dengan menggunakan loop ditusukkan ke dalam medium tegak Baird Parker agar (BPA) yang sudah disiapkan terlebih dahulu. Setiap bakteri yang akan diuji ditusukkan ke dalam dua tabung, dimana tabung pertama ditutupi dengan parafin 3-5 ml, sedangkan tabung kedua tanpa parafin. Inkubasi dilakukan pada suhu
30 oC selama 48 jam. Bila terjadi perubahan warna (terbentuk warna kuning) pada kedua tabung, maka bakteri tersebut bersifat fermentatif dan bila hanya tabung tanpa parafin yang berubah warna (terbentuk warna kuning), maka bakteri bersifat oksidatif, sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna pada kedua tabung tersebut berarti uji oksidatif-fermentatif bersifat negatif.
3.4.11 Uji kualitatif Staphylococcus (Fardiaz 1989)
Untuk uji kualitatif Staphylococcus, medium yang digunakan adalah Baird Parker agar (BPA) yang dicampur dengan egg yolk steril. Bakteri yang akan diuji diinokulasikan ke dalam cawan petri yang berisi medium tersebut dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1-2 hari. Uji dinyatakan positif apabila terbentuk koloni bakteri yang berwarna hitam pada medium yang terkena goresan.
3.4.12 Uji koagulase (Fardiaz 1989)
Dalam uji koagulase digunakan medium brain heart infusion (BHI) dan plasma kelinci. Bakteri yang akan diuji diinokulasi ke dalam tabung reaksi yang berisi BHI sebanyak 5 ml. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 oC selama 24 jam. Setelah inkubasi, ditambahkan 0,3 ml plasma kelinci ke dalam tabung reaksi tersebut dan diinkubasi lagi pada suhu 37 oC selama 1-2 jam. Uji koagulase positif ditandai dengan terbentuknya koagulasi seperti fibrin.
3.4.13 Uji indol (Hadioetomo 1985)
Dalam uji indol digunakan medium tryptone broth. Bakteri yang akan diuji diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi tryptone broth dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1-2 hari. Setelah diinkubasi, masing-masing tabung ditambahkan 0,5 ml pereaksi Kovacs. Terbentuknya warna merah menunjukkan uji indol positif.
3.4.14 Uji reduksi nitrat (Hadioetomo 1985)
Dalam uji reduksi nitrat, bakteri diinokulasi ke dalam nitrate broth. Setelah inkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam, masing-masing bakteri yang akan diuji
diberi tiga tetes larutan asam sulfanilat dan tiga tetes larutan dimetil alpa-naphtylamin. Bila pada bakteri yang diuji dapat mereduksi nitrat menjadi
nitrit, maka akan segera terbentuk warna merah dan hal ini menunjukkan uji reduksi nitrat positif. Apabila perubahan warna tidak jelas, dapat ditambahkan
sedikit serbuk seng ke dalam tabung yang berisi inokulum bakteri. Apabila terbentuk warna merah berarti uji reduksi nitrat negatif, sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna berarti uji reduksi nitrat positif.
3.4.15 Uji H2S, fermentasi glukosa dan pembentukan gas (Fardiaz 1989) Dalam uji ini digunakan medium triple sugar iron agar (TSIA). Uji tersebut bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memfermentasi glukosa, laktosa atau sukrosa, pembentukan gas dari glukosa dan produksi H2S. Prosedur uji ini adalah: Isolat yang akan diuji diinokulasi pada agar miring TSIA dengan cara membuat goresan pada media agar miring dan menusukannya pada bagian bawah agar. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 oC selama 48 jam. Reaksi-reaksi yang terjadi pada medium TSIA dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Reaksi-reaksi pada medium TSIA Bagian bawah agar Bagian atas agar
Reaksi Warna Reaksi Warna Keterangan
Basa Asam Asam Merah Kuning Kuning - Basa Asam Oranye Merah Kuning
Tidak memfermentasi glukosa Fermentasi glukosa Fermentasi laktosa atau sukrosa
Bagian bawah Bagian atas Keterangan
Agar pecah/ terangkat ke atas Agar berwarna hitam
- -
Produksi gas Produksi H2S
Sumber: Fardiaz (1989)
3.4.16 Uji pembentukan asam (Fardiaz 1989)
Cara pengujian pembentukan asam adalah sebagai berikut: Isolat yang akan diuji digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi medium dextrose tripton bromkresol purple agar (DTBPA). Inkubasi dilakukan pada suhu 30 oC selama 24-48 jam. Uji ini dikatakan positif jika terbentuk areal berwarna kuning di sekitar koloni yang tumbuh.
3.4.17 Uji sitrat (Cowan dan Steel 1974)
Bakteri yang akan diuji diinokulasikan pada agar miring yang berisi medium Simmons citrate. Indikator pH yang digunakan untuk uji ini adalah
brothymol blue. Inkubasi dilakukan pada suhu 30 oC selama 48 jam. Uji sitrat positif akan ditandai dengan terjadinya perubahan warna pada medium dari warna hijau menjadi biru. Uji sitrat positif menandakan bahwa bakteri tersebut mampu mengunakan sitrat sebagai sumber karbon.
3.4.18 Uji aktifitas proteolitik (Fardiaz 1989)
Bakteri yang akan diuji digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi medium skim milk agar (SMA). Inkubasi dilakukan pada suhu 30 oC selama 48 jam. Koloni dari organisme yang bersifat proteolitik dan dapat mencerna kasein akan dikelilingi oleh areal yang bening, sedangkan bagian agar yang tidak diinokulasi akan terlihat agak keruh.
3.4.19 Uji hidrolisis lemak (Fardiaz 1989)
Bakteri yang akan diuji digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi medium nutrient agar (NA) ditambah dengan 1 % lemak (mentega) dan indikator neutral red sebagai substrat. Inkubasi dilakukan pada suhu 30 oC selama 48 jam. Koloni yang dapat menghidrolisis lemak menjadi gliserol dan asam lemak akan menyebabkan penurunan pH medium sehingga menyebabkan terbentuknya warna merah pada bagian bawah koloni. Hal ini menunjukkan bahwa uji hidrolisis lemak positif.
3.4.20 Uji hidrolisis pati (Fardiaz 1989)
Bakteri yang akan diuji digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi medium starch agar. Inkubasi dilakukan pada suhu 30 oC selama 48 jam. Setelah inkubasi, koloni yang tumbuh ditetesi larutan gram yodium sehingga semua bagian agar terendam. Uji hidrolisis pati positif ditandai dengan terbentuknya bagian yang transparan (bening) di sekeliling koloni yang tumbuh.
