DETEKSI KOI HERPES VIRUS (KHV) DENGAN METODE
2.3. Prosedur Kerja 1 Isolasi DNA
a. Lisis sel secara enzimatis dengan Proteinase K
Pertama-tama, suhu inkubator diatur pada 55°C, kemudian disiapkan
microtube 1,5 μl steril dan diisi dengan 200 μl Cell Lysis Solution dan 1,5 μl
larutan enzim Proteinase K dengan konsentrasi 20 mg/ml. Sampel ikan (ginjal dan insang) ditimbang sebanyak 5-20 mg dan dimasukkan ke dalam tabung 5 microtube. Masing-masing sampel diberi kode G1 (Ginjal 1), I1 (insang 1), G2
(Ginjal 2 sebagai ulangan), I2 (insang 2 sebagai ulangan) dan I3 (insang 3 sebagai ulangan). Setelah sampel dimasukkan ke dalam microtube kemudian ditambahkan dalam campuran Cell Lysis Solution dan Proteinase K, di-spindown dan di-vortex, lalu diinkubasi semalam pada suhu 55°C.
b. Treatmen dengan RNAse
Sampel yang telah diinkubasi semalam, dikeluarkan dari inkubator dan didiamkan hingga suhu ruang, kemudian ditambahkan 1,5 μl RNAse dengan konsentrasi 4 mg/ml, dihomogenkan dengan cara membolak-balikan tabung sebanyak 30 kali. Sampel diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 1 jam, lalu didinginkan sampai suhu ruang.
c. Presipitasi protein
Sampel yang telah didinginkan sampai suhu ruang kemudian ditambahkan 50 μl Protein Precipitation Solution, dan di-vortex dengan kuat selama 30 detik untuk menghomogenkan Protein Precipitation Solution dengan sampel. Sampel ditempatkan di ice bath selama 10-15 menit dan disentrifus pada suhu 4°C dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 300 μl isopropanol absolut ditambahkan pada microtube yang baru, kemudian supernatan dituangkan pada
microtube tersebut, dihomogenkan dengan cara dibolak-balikkan sebanyak 50 kali, dan disentrifus pada suhu 4°C dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit, supernatan dibuang. Kemudian ditambahkan 300 μl etanol 70% dan dibolak-balikkan beberapa kali untuk mencuci DNA, disentrifuge pada suhu 4°C dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit dan supernatan dibuang. Sampel kemudian dikeringudarakan selama sekitar 2 jam, lalu ditambahkan 50 μl sampai 100 μl IEW (Ion Exchange Water), di-vortex untuk melarutkan DNA, dan disimpan pada suhu minus 20°C.
2.3.2. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Pertama-tama premix disiapkan dengan komposisi sebagai berikut: Nama Bahan Jumlah untuk 1 sampel Jumlah untuk 4 sampel
Primer Forward 1 μl 4 μl Primer Reverse 1 μl 4 μl dNTP 1 μl 4 μl Buffer Ex 1 μl 4 μl Ex Taq 0,05 μl 0,2 μl SDW 4,95 μl 20 μl
Premix dibagikan pada 7 tabung PCR sejumlah masing-masing 9 μl, lalu ditambahkan 1 μl DNA sampel dan divortex. Alat PCR disiapkan dengan pengaturan sebagai berikut: tahap predenaturasi (94°C) selama 3 menit, denaturasi (94°C) selama 30 detik, annealing (56°C) selama 30 detik, extention (72°C) selama 30 menit dan final extention (72°C) selama 3 menit sebanyak 35 siklus. 2.3.3. Elektroforesis
Sebelum melakukan prosedur elektroforesis, terlebih dahulu dibuat gel
agarose yaitu serbuk agarose 0,8-1,9 % dalam 30 ml dalam larutan 1 x TBE (Tris Base, Boric Acid, EDTA) atau 1 x TAE (Tris Base, Glacial Acetic Acid, EDTA). Lalu dipanaskan dalam microwave/hot plate selama 1,5 menit atau larutan sampai mendidih dan menjadi bening. Kemudian larutan dibiarkan sampai hangat (50- 600C). kemudian larutan dituangkan ke dalam cetakan yang telah dilengkapi sisir/comb sebagai cetakan sumur/well elektroforesis. Selanjutnya dibiarkan membeku, kemudian dimasukkan ke dalam bak elektroforesis yang telah berisi larutan buffer elektroforesis (1xTBE atau 1XTAE).
Sampel DNA sebanyak 3 μl dicampurkan dengan 0,5 μl 6x gel-loading buffer, lalu dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat dalam gel dengan menggunakan mikropipet. Setelah itu, 3 µl marker DNA dimasukkan ke dalam sumur di dekat sumur sampel. Selanjutnya bak elektroforesis ditutup dan dialiri listrik dengan tegangan 200 volt dan kuat arus 60 mA. Setelah DNA bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif mencapai ¾ bagian dari panjang gel (dapat diamati dari migrasi pewarna loading dye), maka proses elektroforesis dapat dihentikan. Setelah itu, gel diangkat bak elektroforesis dan dilepaskan dari cetakan untuk selanjutnya diamati dengan menggunakan ultraviolet transluminator dengan panjang gelomnbang pendek (280 nm) melalui kamera digital Canon®Powershot A640 yang sudah terhubung ke komputer dengan pemotretan secara otomatis menggunakan bantuan software (image capture).
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1. Hasil
Hasil elektroforesis sampel DNA dari ginjal dan insang ikan koi ditunjukkan oleh gambar 1.
Gambar 1. Amplifikasi DNA Sampel
Keterangan : M (Marker), I1 (Insang 1), G1 (Ginjal 1), I2 (Insang 2), G2 (Ginjal 2), I3 (Insang 3), (+) kontrol positif, (-) kontrol negatif.
3.2. Pembahasan
Menurut Hilwa (2004), analisa DNA yang dilakukan meliputi tahap ekstraksi, PCR, dan Elektroforesis. Tahap pengambilan genom DNA dari sumber sel pada organ atau bagian tubuh ikan sampel. Sedangkan untuk melakukan analisa DNA diperlukan DNA bentuk yang murni. Ekstraksi dan pemurnian DNA berlangsung dalam lima tahapan kegiatan, yaitu penghancuran sel penghilangan RNA, pengendapan protein, pengendapan DNA, dan hibridisasi DNA.
PCR (polymerase chain reaction) atau reaksi rantai polimerase adalah suatu proses untuk mengamplifikasi (memfotokopi) molekul DNA yang diinginkan secara in vitro (di luar tubuh makhluk hidup). Prinsip PCR diilhami oleh proses penggandaan DNA yang terjadi secara alamiah dalam tubuh makhluk hidup, yang kita kenal dengan istilah replikasi. Pada proses PCR, hasil fotokopi tidak lain
merupakan primer yang diperpanjang oleh enzim DNA polimerase, ketika menempel pada salah satu untai templat DNA (molekul DNA yang menjadi target fotokopi). Primer merupakan oligonukleotida (beberapa nukleotida) spesifik yang dirancang untuk membatasi fragmen DNA yang akan diamplifikasi (seperti diketahui DNA merupakan polinukleotida). Dengan adanya variasi suhu dan bantuan enzim DNA polimerase, primer tersebut dapat menempel dan menyalin informasi genetik sama persis dengan templat DNA, sehingga akhirnya didapatkan jumlah molekul DNA target yang memadai (Pikiran-Rakyat, 2006).
Proses elektroforesis dimulai dengan pembuatan gel agarose. Menurut Muladmo (2002) dalam Hilwa (2004), pada prinsipnya DNA dapat berintegrasi di dalam gel dalam bentuk padat yang diletakkan dalam larutan penyangga yang dialiri arus listrik. Salah satu gel yang biasa digunakan adalah gel agarose. Ketika elektoforesis berlangsung, molekul DNA yang bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak atau bermigrasi ke arah positif (anode). Kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh beberapa faktor, salah satunya adalah ukuran molekulnya. Migrasi molekul DNA berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil (Hilwa, 2004).
Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dulu gel direndam di dalam larutan etidium bromid (Wibowo, 2009).
Berdasarkan hasil elektroforesis (Gambar 1), terlihat bahwa sampel I1, I2, I3, G1, dan G2 menunjukkan hasil negatif atau tidak terkena KHV yang ditunjukkan dengan tidak adanya pita yang terbentuk pada gel. Hal ini disebabkan oleh tidak terjadinya proses amplifikasi karena sampel tidak mengandung template DNA yang komplemen dengan primer gen KHV. Gen penyandi KHV
berukuran 400 bp yang ditunjukkan oleh kontrol positif. Dengan demikian ikan mas yang dijadikan sampel tidak terserang KHV.
Praktikum ini bertujuan untuk mendeteksi penyakit viral yang disebabkan oleh KHV (Koi Herpes virus). KHV merupakan penyakit viral pada ikan mas dan koi yang sangat menular dan mengakibatkan morbiditas dan mortilitas antara 80- 100% dari populasi ikan, dengan masa inkubasi 1-14 hari. Individu yang bertahan hidup sekitar 20% pada saat terjadi wabah umumnya akan menjadi resisten terhadap infeksi berikutnya. Namun ketahanan tersebut tidak menunjukan adanya transfer kepada turunananya (Taukhid et al., 2005).
Koi herpesvirus diidentifikasi pertama kali tahun 1998 yang menyebabkan kematian massal pada ikan mas budidaya di Israel (Gilad et al., 2003) dan Amerika Serikat (Gray et al., 2002). Carp nephritis and gill necrosis virus
(CNGV) adalah nama awal virus yang berasal dari virus DNA yang morfologinya mirip dengan anggota kelompok Herpesviridae yang nama lainnya adalah koi herpesvirus dan Cyprinid herpesvirus (Dishon et al. 2005). Nama lain dari virus KHV adalah Cyprinid Herpesvirus 3 atau CyHV-3 (Aoki et al., 2007). Virus ini masuk ke Indonesia pada tahun 2002 melalui perdagangan ikan koi (Sunarto et al., 2005).
Virus herpes merupakan virus yang berukuran besar dibandingkan dengan virus lain. KHV memiliki kapsid simetri ikosahedral dengan diameter 100-110 nm, sedangkan virion matang memiliki amplop yang longgar sehingga ukuran diameternya menjadi 170-230 nm. Selain itu juga terdapat benang-benang penyangga seperti struktur tegument pada permukaan inti yang mirip dengan kelompok Herpesvirus (Pokorova et al., 2005).
Hasil pemotongan tipis pellet virus yang telah dimurnikan menunjukkan adanya partikel yang terbungkus dengan struktur seperti benang pada permukaan inti (Hutoran et al., 2005). KHV juga berisi daerah padat-elektron asimetrik yang relatif kecil di dalam inti viral yang kemungkinan merupakan DNA genomik dan kompleks nucleoprotein (Hutoran et al., 2005).
Secara morfologi, anggota virus herpes mempunyai arsitekrtur yang serupa. Morfologi struktur virus herpes dari bagian dalam ke bagian luar terdiri genom DNA untai ganda linier berbentuk toroid, kapsid, lapisan tegumen dan selubung.
Kapsid terdiri atas protein yang tersusun dalam simetri ikosahedral. Menurut Miwa et al. (2007) inti sel yang terinfeksi KHV mengandung banyak kapsid KHV dengan diameter 10 nm dan morfologi yang bervariasi.
Kelompok herpesvirus umumnya memiliki karakter yang unik, yaitu memiliki kemampuan untuk survive latent dalam sel inang untuk jangka waktu yang lama dan akan menjadi aktif kembali apabila ada pemicu seperti perubahan lingkungan atau stress yang terjadi pada inang (Taukhid et al., 2005). Sejumlah virus herpes tinggal tetap dalam bentuk laten seumur hidup induk semangnya (Malole, 1989).
Mekanisme penularan KHV umumnya terjadi melalui kontak antar ikan, cairan dari ikan yang terinfeksi, lewat air atau lumpur yang terkontaminasi, serta peralatan perikanan (Sunarto et al., 2005). Hal ini didukung pula oleh pendapat Crane et al. (2004) yang menyatakan bahwa partikel virus KHV dapat bertahan hidup di air selama 20 Jam dan lebih lama pada kolam pada kondisi buruk, ada yang menyebutkan juga bahwa dapat bertahan di luar inang (dalam air) dan masih infektif sekurang-kurangnya selam 4 jam. Di sisi lain mekanisme infeksi KHV sangat dipengaruhi pula oleh faktor suhu lingkungan (Gilad et al., 2003).
Virus ini dapat menginfeksi ikan pada suhu lingkungan yang sangat spesifik, yaitu pada suhu air 18-24oC (Hutoran et al., 2005), 18-28oC (Gilad et al., 2003) pada sistem budidaya. Penyakit ini sangat ganas dan dapat menyebabkan kematian massal 80-100% pada suhu 17-270C (Perelberg et al., 2003). Namun kematian ikan akan menurun bahkan berhenti bila berada di atas dan di bawah kisaran toleransi suhu tersebut (Gilad et al., 2003). Kisaran suhu optimal bagi kehidupan KHV yang diamati pada penelitian secara in vitro yaitu pada kisaran 15-25oC dan tidak ada atau minimum replikasinya pada suhu 4, 10, 30, 37oC (Gilad et al., 2003).
Gambar 2. Ikan terserang KHV (Hartman et al., 2004)
Gejala klinis ikan mas yang terinfeksi KHV menunjukkan kondisi ikan yang lemah, kehilangan keseimbangan dan kesulitan bernafas. Penampakan ikan yang umum terjadi yaitu pengelupasan epitelium dengan produksi mukus berkurang dan kulit terasa kasar, pendarahan (hemorargi) pada operculum, sirip ekor dan perut yang disertai kerusakan pada insang (Sunarto et al., 2005). Lebih lengkap Taukhid et al. (2005) menunujukan beberapa gejala-gejjala yang timbul pada ikan mas dan koi yang terinfeksi koi herpes virus: a) produksi lendir (mukus) berlebih sebagai respon fisiologis terhadap kehadiran patogen, selanjutnya produksi lendir menurun drastis sehingga tubuh ikan terasa kasar. b) insang berwarna pucat dan terdapat bercak putih atau coklat (sebenanrnya adalah kematian sel-sel insang atau nekrosa insang), selanjutnya menjadi rusak, geripis pada ujung tapis insang dan akhirnya membusuk. Secara mikroskopis terjadi adanya kerusakan jaringan yang serius serta kematian sel yang berat. c) pendarahan (hemorargi) disekitar pangkal dan ujung sirip serta permukaan tubuh lainnya, d) adanya kulit melepuh, e) hati berwarna pucat selanjutnya menjadi rusak, f) ginjal (anterior dan posterior) berwarna pucat.
IV. KESIMPULAN DAN SARAN
4.1. Kesimpulan
Sampel yang berasal dari ikan mas yang digunakan dalam praktikum ini menunjukkan hasil negatif KHV. Hal ini berdasarkan tidak adanya pita yang terbentuk pada gel elektroforesis. Gen penyandi KHV berukuran 400 bp yang ditunjukkan oleh kontrol positif.
4.2. Saran
Sebelum pengambilan sampel sebaiknya dilakukan diagnosa terhadap gejala klinis ikan agar memungkinkan didapat sampel dari ikan sakit dan ikan sehat, sehingga dapat dibedakan sampel positif dan negatif KHV.
DAFTAR PUSTAKA
Aoki T, Hirono I, Kurokawa K, Fukuda H., Nahary R, Eldar A, Davidson AJ, Waltzek TB, Bercovier H, Hedrick RP. 2007. Genomic sequences of three koi herpesvirus isolates representing the expanding distribution of an emerging diseases threatening koi and comon carp worldwide. J. Virol, 81 (10): 5058-5065.
Crane M, Sano M, Komar C.2004.Infection with Koi herpesvirus-disease card. Develop to support the NACA/FAO/OIE Regional quarterly aquatic animal disease (QAAD) reporting system in the Asia Pasific. NACA, Bangkok, Thailand. 11pp.
Dishon A, Parerlberg A, Bishar-Shieban J. Ilouze M, Davidovich M, Warker S, Kotler M.2005. Detection of carp interstitial nephritis and gill necrosis virus in fish dropping. Applied and Environmental Microbiology,71(11): 7285- 7291.
Gilad, O., Yun, S., Andree, K., Adkison, M., Zlotkin, A., Bercovier, H., Eldar, A., Hedrick, R. 2003. Molecular comparison of isolates of an emerging fish patogen, koi herpesvirus and the effect of water temperature on mortality of experimentally infected koi. Journal of General Virology, 84: 2661-2668. Gray WL, Mullis L, LaPatra SE, Grott JM, Goodwin A. 2002. Detection of Koi
herpesvirus DNA in Tissues ofinfected fish. J. Fish Disease, 25:171-178. Hartman, K.H., Yanong, R.P.E., Petty, B.D., Francis-Floyd, R. and Riggs, A.C.
2004. Koi Herpes Virus (KHV) Disease. University of Florida.
Hedrick, R.P., Gilad, O., Yun, S., Spangenberg, J.V., 2000. A Herpes Virus associated with mass mortality of juvenile and adult koi, a strain of common carp. Aquatic Animal Health, 12: 44-57.
Hilwa, Z. 2004. Karakterisasi Genotip Ikan Lele Sangkuriang Dengan Metode PCR-RFLP ADN Mitokondria. Skripsi. Program Studi Teknologi dan Manajemen Akuakultur. Departemen Budidaya Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Hutoran, M., Ronen, A., Perelberg, A., Ilouze, M., Dishon, A., Bejerano, I., Chen, N., and Kotler, M. 2005. Description of an as yet unclassifield DNA virus from diseased Cyprinus carpio species. J. Virol.,79: 1983–1991.
Malole, M.B.M., Pramono, C.S.U. 1989. Penggunaan Hewan-hewan Percobaan di Laboratorium. Departemen Pendidikan dan kebudayaan. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi. PAU. IPB.
Perelberg, A., Smirnov, M., Hutoran, M., Diamant, A., Bejerano, T., Kotler, M., 2003. Epidemiological description of new viral disease affecting cultured
Cyprinus carpio in Israel. Bamidgeh, 55: 5-12.
Pikiran-rakyat. Memfotocopi DNA dengan PCR. http://www.pikiran-rakyat.com/ [1 Desember 2008].
Sunarto, A., Rukyani, A., Itami, T., 2005. Indonesian experience on the outbreak of Koi Herpesvirus in koi and carp (Cyprinus caprio). Bull. Fish. Res. Agen. Suplement, 2: 15-21.
Taukhid, A., Komarudin, O, Supriyadi, H., Bastiawan, D. 2005. Strategi Pengendalian Penyakit pada Budidaya Ikan Air Tawar. Kumpulan Makalah Strategi Pengelolaan dan Pengendalian Penyakit KHV. Pusat Riset Perikanan Budidaya. Jakarta.
Wibowo, M. S. 2009. Elektroforesis. Sekolah Farmasi. Institut Teknologi Bandung.