BAB III. METODE PENELITIAN
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1. Preparasi Sampel Air cucian beras
Sebanyak 150 gram sampel beras dicuci dengan 200 mL air bersih, kemudian air bilasan pertama ditampung kedalam botol kaca steril sekitar 2/3 dari volume botol. Setelah itu mulut botol ditutup menggunakan kain berpori atau kertas saring dan diikat menggunakan karet gelang atau tali. Fermentasi sampel air cucian beras dilakukan selama tiga hari (Elfarisna et al, 2014; Ikeda et al, 2013), disimpan
14
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pada suhu ruangan dan terhindar dari cahaya langsung. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah cairan keruh yang berada pada lapisan tengah dari hasil fermentasi air cucian beras.
3.3.2. Isolasi Bakteri dari Fermentasi Air cucian beras
Sebanyak 1 mL sampel secara aseptis ditambahkan kedalam 9 mL pepton water 1%. Selanjutnya dilakukan homogenisasi menggunakan vortex hingga larutan sampel terlihat homogen. Suspensi yang diperoleh (pengenceran 10-1) diencerkan dengan metode pengenceran bertingkat hingga 10-7 dengan mengambil 1 mL dari hasil pengenceran sebelumnya kemudian ditambahkan kedalam 9 mL
pepton water 1%. Hasil pengenceran 10-5 sampai 10-7 diambil sebanyak 100 µL dan dimasukkan kedalam cawan petri berisi media MRS Agar yang ditambahkan dengan CaCO3 1% menggunakan metode sebaran (spread plate) secara triplo,
kemudian diinkubasi pada suhu γ7˚C selama β hari (N, Suhartatik et al, 2014 dengan modifikasi).
3.3.3. Pemurnian Isolat Bakteri dari Fermentasi Air cucian beras
Pemurnian dilakukan terhadap bakteri yang menghasilkan zona bening disekeliling koloni bakteri tersebut. Strain bakteri murni diperoleh setelah menginokulasikan bakteri pada medium agar baru dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu γ7˚C. Tahap pemurnian dilakukan sekitar 4-5 kali untuk memperoleh isolat murni (koloni tunggal). Pemeliharaan kultur dilakukan pada semua isolat yang didapatkan. Kultur murni disimpan pada media MRS Agar miring, pada suhu
4˚C-10˚C (Misgiyarta dan Widowati, 2002).
3.3.4. Karakterisasi Isolat Bakteri dari Fermentasi Air cucian beras
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat (BAL) umumnya dilakukan berdasarkan karakteristik morfologi, fisiologi, dan biokimia.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.3.4.1.Karakterisasi Morfologi Isolat Bakteri dari Fermentasi Air cucian
beras
Karakterisasi morfologi BAL umumnya dilakukan dengan dua cara yaitu makroskopik dan mikrosopik. Karakterisasi morfologi BAL secara maskroskopik dilakukan dengan cara melihat langsung morfologi isolat bakteri yang tumbuh pada medium (Ibrahim et al, 2015). Secara visual karakteristik yang dapat diamati dari koloni BAL meliputi bentuk koloni, bentuk tepi, warna dan bentuk permukaan (Romadhon et al, 2012).
Karakterisasi morfologi bakteri secara mikroskopik dilakukan degan uji pewarnaan Gram dan pewarnaan endospora:
a) Pewarnaan Gram dilakukan dengan membersihkan kaca objek menggunakan alkohol 70% dan dilewatkan beberapa kali diatas api bunsen, kemudian diambil isolat bakteri dengan jarum ose secara aseptik dan dioleskan pada kaca objek. Isolat bakteri kemudian ditetesi kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit, selanjutnya dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Isolat bakteri kemudian ditetesi lagi dengan larutan iodine dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Selanjutnya isolat bakteri ditetesi alkohol 96% selama 30 detik, kemudian dialiri air dan dianginkan hingga kering (Hadioetomo, 1993 dalam Yulvizar, 2013). Isolat bakteri kemudian ditetesi safranin selama 30 detik dan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan, kemudian preparat diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x untuk melihat bentuk dan warna dinding sel (Sharah, Karnila dan Desmelati, 2015). Bakteri Gram positif ditandai dengan warna ungu yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut mampu mengikat warna kristal violet, sedangkan bakteri Gram negatif ditandai dengan warna merah yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak mampu mengikat warna kristal violet dan hanya terwarnai oleh safranin (Hadioetomo, 1993 dalam Yulvizar, 2013).
b) Pewarnaan endospora dilakukan dengan membuat preparat ulas menggunakan kaca objek, kemudian difiksasi diatas api bunsen. Preparat ditutup dengan kertas saring dan ditetesi dengan malachit hijau, kemudian preparat diletakkan
16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta di atas kawat yang dipanaskan dengan uap air mendidih selama 5 menit. Preparat dicuci secara hati-hati dengan air mengalir. Preparat ditetesi dengan menggunakan safranin, didiamkan selama 60 detik kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan hati-hati. Preparat diamati dengan mikroskop, uji positif jika sel vegetatif berwarna merah dan spora berwarna hijau (Lay, 1994 dalam Misgiyarta dan Widowati, 2008).
3.3.4.2.Karakterisasi Fisiologi dan Biokimia Isolat Bakteri dari Fermentasi Air cucian beras
Karakterisasi fisiologi dan biokimia BAL meliputi: a) Uji Katalase
Isolat dari media agar miring diambil satu ose, kemudian dioleskan pada kaca objek yang telah dibersihkan menggunakan alkohol 70%. Kemudian ditetesi dengan larutan H2O2 3%. Diamati terbentuknya gelembung gas pada preparat, jika terdapat gelembung gas berarti uji katalase tersebut positif (Lay, 1994
dalam Misgiyarta dan Widowati 2008). Terbentuknya gelembung-gelembung oksigen menunjukkan bahwa organisme tersebut menghasilkan enzim katalase yang mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen (Hadioetomo, 1993 dalam Yulvizar, 2013). BAL termasuk bakteri katalase negatif sehingga hasil reaksi uji katalase tidak terbentuk gelembung gas yang menunjukkan bahwa BAL tidak menghasilkan enzim katalase (Romadhon et al, 2012). Hanya isolat yang menunjukkan hasil pewarnaan Gram positif dan katalase negatif yang akan didentifikasi lebih lanjut karena kedua hasil uji tersebut merupakan sifat umum BAL (Sharpe, 1979 dalam Muzaifa, 2014).
b) Uji Motilitas
Sebanyak 1 ose isolat bakteri diambil dari stok kultur kemudian ditusukkan kedalam media SIM semi padat pada tabung reaksi menggunakan jarum ose
tusuk steril. Kemudian diinkubasi selama β4 jam pada suhu γ7˚C. Uji positif
ditandai dengan pertumbuhan bakteri yang menyebar (motil) dan uji negatif ditandai dengan pertumbuhan bakteri yang tidak menyebar dan hanya berupa satu garis (non motil) (Sudarsono, 2008 dalam Yulvizar, 2013).
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta c) Uji Tipe Fermentasi
Uji tipe fermentasi digunakan untuk menggolongkan BAL kedalam kelompok homofermentatif atau kelompok heterofermentatif. Uji dilakukan dengan cara menumbuhkan kultur bakteri pada MRS Broth dalam tabung reaksi yang berisi
tabung durham. Inkubasi dilakukan selama β hari pada suhu γ7˚C. Pengamatan
dilakukan dengan melihat terbentuknya gelembung udara pada tabung durham (Romadhon et al, 2012). Isolat yang dapat menghasilkan gas (CO2) merupakan bakteri heterofermentatif, sedangkan isolat yang tidak menghasilkan gas disebut bakteri homofermentatif.
d) Uji Pertumbuhan Bakteri pada Suhu yang Berbeda
Kultur bakteri berusia 24 jam sebanyak 1 ose diinokulasikan pada media MRS
Broth kemudian diinkubasi selama β hari pada suhu 15˚C, γ7˚C dan 45˚C.
Tingkat pertumbuhan bakteri diamati secara visual berdasarkan intensitas kekeruhan (Thakkar et al, 2015 dengan modifikasi).
e) Uji Pertumbuhan Bakteri pada Konsentrasi NaCl yang Berbeda
Pertumbuhan bakteri pada konsentrasi NaCl 4% dan 6,5% dilakukan pada media MRS Broth selama 24 jam. Adanya pertumbuhan bakteri ditandai dengan kekeruhan dalam tabung (Guessas dan Kihal, 2004 dengan modifikasi).
3.3.4.3.Uji Hemolitik Isolat Bakteri dari Fermentasi Air cucian beras
Kultur bakteri berusia 24 jam diinokulasikan kedalam media blood agar dan
diinkubasi pada suhu γ7˚C selama 48 jam. Aktifitas hemolitik pada kultur bakteri
diperiksa untuk mengetahui apakah isolat bakteri yang diperoleh merupakan bakteri patogen atau non patogen. Hasil uji hemolitik dikelompokkan menjadi 3 golongan, yaitu hemolitik-α (terbentuk zona hijau disekitar koloni bakteri), hemolitik-(terbentuk zona bening disekitar koloni bakteri), atau hemolitik- (tidak terbentuk
zona bening disekitar koloni bakteri) pada media blood agar. Bakteri patogen ditandai dengan adanya reaksi yang terjadi antara bakteri yang tumbuh dengan media blood agar, yaitu terbentuknya zona disekitar koloni bakteri yang tumbuh.
18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Sedangkan pada hasil uji bakteri non patogen tidak terbentuk zona disekitar koloni bakteri (Modifikasi Hargrove dan Alford, 1978 dalam Hawaz, 2014).
