II. METODOLOGI PENELITIAN
2.4 Prosedur Penelitian
2.4.1 Persiapan Wadah Pemeliharaan Larva Ikan Nemo
1. Menyiapkan wadah plastik berbentuk persegi berukuran 35 x 22 x 22 cm sebanyak 12 buah dan disusun disebuah bak fiber berukuran 2 x 1 m serta dilengkapi dengan heater untuk mencegah suhu yang berfluktuatif.
Yij = μ + σi + єij
a b
c
d e
9
2. Wadah plastik dibersihkan dengan cara direndam dengan menggunakan kaporit, kemudian wadah dibilas dengan air laut steril dan dikeringkan selama 12 jam.
3. Wadah pemeliharaan diisi air laut steril sebanyak 17 liter dan dilengkapi dengan instalasi aerasi kemudian ditata dalam bak fiber yang sudah diisi air dengan ketinggian 5 cm (Lampiran 1).
2.4.2 Persiapan Wadah Pengkayaan Pakan Alami.
1. Wadah yang digunakan untuk pengkayaan pakan alami berupa wadah plastik berkapasitas 2,5 liter, sebanyak 4 buah.
2. Wadah dicuci dan dikeringkan sebelum digunakan. Volume air yang digunakan yaitu 1 liter dan dilengkapi dengan instalasi aerasi (Lampiran 1).
2.5 Pelaksanaan Penelitian. 2.5.1 Pengkayaan Artemia sp.
Sampel Artemia sp. sebanyak 2 gram diperkaya dengan berbagai bahan pengkaya, dibekukan dan diberikan untuk larva ikan nemo yang dipelihara secara tertutup. Pemberian naupli Artemia sp. untuk pakan ikan nemo dilakukan pada saat larva berumur D7 – D20 sebanyak dua kali sehari, yaitu pagi hari pukul 09.00 WIB dan sore hari pukul 15.00 WIB. Perlakuan tersebut adalah sebagai berikut :
1. Kista Artemia sp. sebanyak 8 gram ditetaskan. Setelah 24 jam, naupli Artemia sp. dipanen dan dimasukkan ke dalam 4 wadah pengkaya.
2. Tepung Spirullina sp. ditimbang sebanyak 1 gram, kemudian dicampurkan ke dalam wadah pengkaya yang berisi naupli Artemia sp. dan 1 liter air yang dipelihara selama 5 jam. Kemudian naupli Artemia sp. dipanen dengan cara disaring dan dibekukan dalam freezer selama 2 jam (Perlakuan B).
3. Naupli Artemia sp. dimasukkan ke dalam wadah pengkaya yang berisi 1 liter air. Selanjutnya, dimasukkan Nannochloropsis sp. dan Isochrysis sp. (kepadatan masing-masing 3 x 106 sel/ml) sebanyak 600 ml dan 400 ml disaring, dimasukkan ke dalam wadah pengkaya dan dipelihara selama 5
10
jam. Setelah 5 jam naupli Artemia sp. dipanen dengan cara disaring, dan dibekukan dalam freezer selama 2 jam (Perlakuan C).
4. Tepung Spirullina sp. sebanyak 0,5 gram dicampurkan ke dalam wadah pengkaya. Nannochloropsis sp. dan Isochrysis sp. (kepadatan masing-masing 3 x 106 sel/ml) sebanyak 300 ml dan sebanyak 200 ml disaring, dimasukkan kedalam wadah pengkaya, kemudian naupli Artemia sp. dimasukkan pada wadah tersebut. Selanjutnya Artemia sp. dipelihara selama 5 jam. Setelah 5 jam naupli Artemia sp. dipanen dengan cara disaring, kemudian dibekukan dalam freezer selama 2 jam (Perlakuan D).
2.5.2 Pemeliharaa Larva Ikan Nemo.
1. Larva dipelihara di dalam wadah plastik berbentuk persegi berukuran 35 22 x 22 cm dengan volume 17 liter yang disusun didalam bak fiber dengan ukuran 2m x 1m serta diletakkan pada semi outdoor (Lampiran 1).
2. Setiap wadah pemeliharaan diisi larva ikan sejumlah 30 ekor.
3. Larva dipelihara mulai umur D7 – D20 dan diberi pakan beku naupli Artemia sp. yang telah diperkaya.
4. Pemberian pakan dilakukan setiap hari sebanyak 2 kali yaitu pada pukul 09.00 WIB dan 15.00 WIB.
5. Pengukuran parameter kualitas air dilakukan setiap hari meliputi suhu, pH, untuk DO dan salinitas diukur setiap lima hari sekali. Pengukuran konsentrasi ammonia dilakukan pada awal, tengah, dan akhir pemeliharaan.
6. Penghitungan sintasan larva dilakukan setiap hari selama pemeliharaan. 7. Pemanenan dilakukan pada D-21 dengan cara mengukur panjang dan berat
tubuh larva ikan nemo.
8. Reinfeksi dilakukan pada D-30 untuk mengetahui daya tahan larva ikan nemo terhadap infeksi bakteri V.alginolitycus.
2.5.3 Reinfeksi Bakteri Vibriosis.
1. Isolat bakteri Vibrio alginolyticus (Lampiran 3) yang telah tersedia dan disimpan dalam refrigerator kemudian diaktifkan kembali dengan melakukan reinfeksi bakteri.
11
2. Reinfeksi dilakukan sebanyak 2 kali untuk meningkatkan keganasan bakteri.
3. Isolat diisolasi ke media TSA miring dengan menggunakan jarum ose steril yang telah dipanaskan diatas bunsen lalu disimpan di inkubator pada suhu 35oC.
4. Isolat dari media TSA diisolasi kembali ke media TSB dan dilakukan reinfeksi pertama pada ikan sampel (3 ekor) sebanyak 0,05 ml/ekor melalui penyuntikan.
5. Setelah 1 minggu, dilakukan isolasi kembali dari ikan yang telah direinfeksi ke media TSA dan TCBS kemudian disimpan.
6. Isolat yang tumbuh diisolasi kembali ke media TSB untuk kemudian direinfeksi pada ikan.
7. Setelah 1 minggu dilakukan isolasi kedua sama seperti reinfeksi pertama. Isolat bakteri kemudian digunakan untuk uji LD50 dan uji tantang sesuai dengan tingkat kepadatan yang digunakan.
2.5.4 Uji LD50.
1. Bakteri dari organ hati dikultur dalam 5 cawan yang berisi media TSA. 2. Setelah bakteri tumbuh dilakukan panen bakteri menggunakan NaCl
fisiologis sebanyak 3 ml.
3. Setelah itu, bakteri yang telah dipanen menggunakan NaCl fisiologis sebanyak 3 ml dicampurkan kedalam 1 liter air.
4. Kemudian dihitung kepadatanya dengan spektrofotometer hingga mencapai konsentrasi 3 x 109.
5. Jika konsentrasi belum mencapai 3 x 109 larutan ditambahkan kembali dengan larutan bakteri yang telah dipanen sebelumnya.
6. Jika konsentrasi sudah mencapai 3 x 109 kemudian 5 cawan teresebut dijadikan dalam 1 wadah.
7. Selanjutnya konsentrasi diturunkan dari 109 sampai dengan 106.
8. Kemudian ikan dimasukkan dan tunggu hingga 1 minggu untuk melihat pada konsentrasi berapa ikan mati setengah dari populasi.
12
2.5.5 Uji Patogenisitas
Patogenitas bakteri Vibriosis adalah sebagai berikut :
1. Ikan uji sebanyak 15 ekor berumur ± 21 hari disiapkan kemudian dimasukkan ke wadah pemeliharaan.
2. Bakteri V. alginolyticus dengan kepadatan 1,69 x 107 dimasukkan dalam media pemeliharaan.
3. Ikan uji dipelihara selama satu minggu dengan mengamati gejala klinis yang timbul dan menghitung sintasan akhir larva ikan nemo dihitung dengan rumus yang dikemukakan oleh Brite dkk, (2007) :
Keterangan : M : log LD50
Xi : log dosis bakteri dibawah LD50
D : selisih log dosis di bawah LD50 dan di atas LD50
%xi : presentase kematian komulatif pada dosis di bawah LD50 Xi+1 : presentase kematian komulatif pada dosis di atas LD50
2.6 Parameter Penelitian. 2.6.1 Survival Rate (SR).
Sintasan merupakan nilai perbandingan antara jumlah organisme yang hidup di akhir pemeliharaan dengan jumlah organisme awal saat penebaran yang dinyatakan dalam bentuk persen (Effendie, 2002). Sintasan atau kelangsungan hidup (SR) dihitung berdasarkan persamaan yang dikemukakan oleh Zonneveld et al. (1991), yaitu :
Keterangan :
SR : Kelangsungan hidup (%) Nt : Jumlah ikan akhir (ekor) No : Jumlah ikan awal (ekor)
13
2.6.2 Pertumbuhan Bobot Mutlak.
Pertumbuhan merupakan proses perubahan perubahan individu atau biomassa pada periode waktu tertentu (Effendi, 2002). Pertumbuhan berat mutlak merupakan selisih berat total tubuh ikan pada akhir penelitian dengan berat total tubuh ikan pada awal penelitian. Perhitungan berat mutlak dilakukan dengan persamaan berikut ini :
Keterangan :
Wm : Pertumbuhan berat mutlak (gram) Wt : Bobot rata-rata akhir penelitian (gram) Wo : Bobot rata-rata awal penelitian (gram)
2.6.3 Pertumbuhan Panjang Mutlak.
Pertumbuhan panjang mutlak merupakan selisih panjang total tubuh ikan pada akhir penelitian dengan panjang total tubuh ikan pada awal penelitian. Perhitungan panjang mutlak dapat dihitung dengan persamaan (Effendi, 1997) :
Keterangan :
Lm : Pertumbuhan panjang mutlak (gram) Lt : Panjang rata-rata akhir penelitian (gram) L0 : Panjang rata-rata awal penelitian (gram)
2.6.4 Daya Tahan Larva Ikan Nemo terhadap Infeksi Vibriosis.
Sebanyak 15 ekor larva ikan nemo diinfeksi dengan Vibrio alginolyticus dengan dosis kronis (107). Sintasan larva ikan nemo dihitung dan gejala yang timbul pra dan pasca infeksi di deskripsikan.
Wm = Wt– W0
14
2.6.5 Pergantian Air dan Pengontrolan Kualitas Air
Pengontrolan media pemeliharaan dilakukan setiap hari dengan menyipon kotoran sisa pakan dan feses yang ada di dasar kolam dan pengecekan kualitas air. Volume air ditambah sehingga volume kembali seperti semula. Parameter kualitas air yang diukur setiap hari adalah pH, suhu, kemudian parameter DO dan salinitas diukur setiap 5 hari sekali. Sedangkan amoniak (NH3) diukur pada awal, tengah dan akhir penelitian.