BOGOR
2009
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp.: Analisis Penghasil Senyawa Antimikrob dan Keragaman Genetiknya adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Juli 2009
Hermawaty Abubakar G351070021
ABSTRACT
HERMAWATY ABUBAKAR. Spons (Jaspis sp.) – Associated Bacteria: Antimicrobial Production and Genetic Diversity Analyses. Under Direction of Aris Tri Wahyudi and Munti Yuhana.
ABSTRACT
Living benthic marine organisms such as sponges are frequently assosiated with bacteria which may produce useful antimicrobial compounds. Genetic diversity of bacteria isolated from marine spongeJaspissp. which has capability in producing antibacterial subtances was investigated. As many as 32 isolates (45,71%) and 20 (29,41%) isolates originating from mesohyl and sponge surface respectively, showed the antibacterial activity againstStaphylococcus aureus, Vibrio harveyi, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterophatogenic Escherichia coli (EPEC K-11),
Candida albicans, and C. tropicalis. Thirty most potential isolates were further studied by amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) to asses their genetic diversity. Restriction analysis using enzymes RsaI, HaeIII, and HinfI of the 16S rRNA genes resulted seven phylotipes. The 16S rRNA gene sequence of choosen isolates i.e. SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, SAB E-40 and SAB S-43 that showed inhibition of the growth for all microorganism target were identified. The use of a few phenotypic tests for those isolate can be applied to differentiate them. Gram staining technique was used to distinguish Gram negative from Gram positive ones. Isolates designed as SAB E-8, SAB E-35, and SAB E-40 were identified as Gram negative, whereas SAB E-33, SAB E-38, and SAB S-43 were Gram positive. For Gram positive isolates, further test were performed including spora staining and catalase test forBacillusidentification. Based on their 16S rRNA gene sequences, there were 3 isolates closely related to Pseudomonas sp. while the remaining 3 isolates were members ofBacillusgroup.
Keywords: Sponge – Associated Bacteria, ARDRA, 16S rRNA, antimicrobial compounds, genetic diversity
Analisis Penghasil Senyawa Antimikrob dan Keragaman Genetiknya. Dibimbing oleh Aris Tri Wahyudi dan Munti Yuhana.
Spons merupakan salah satu komponen biota penyusun terumbu karang yang mempunyai potensi bioaktif yang belum banyak dimanfaatkan. Hewan laut ini mengandung senyawa aktif yang persentase keaktifannya lebih besar dibandingkan dengan senyawa-senyawa yang dihasilkan oleh tumbuhan darat. Spons umumnya dapat bertahan hidup di perairan laut yang miskin nutrisi karena adanya assosiasi dengan organisme lain khususnya bakteri.
Bakteri banyak ditemukan secara komensal di permukaan dan bagian mesohyl spons. Pola makan spons yang khas yaitu filter feeder (menghisap dan menyaring) dapat memanfaatkan jasad renik disekitarnya sebagai sumber nutrien, diantaranya bakteri yang hidup pada perairan tersebut. Namun seringkali bakteri juga dijumpai hidup dan berkolonisasi dengan memanfaatkan nutrien yang terdapat pada spons tersebut.
Produk alami laut sebagai hasil metabolik sekunder kemungkinan dihasilkan oleh kehadiran mikroorganisme pada jaringan spons sebagai simbion, baik simbion intraselluler ataupun ekstraselluler. Senyawa-senyawa organik tersebut dapat ditransport karena adanya kerjasama antara simbion dan inangnya. Kehadiran kedua pasangan simbion ini juga menjadi syarat untuk menghasilkan metabolik sekunder seperti senyawa bioaktif yang bersifat antimikrob. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri (endosimbion dan ektosimbion) penghasil senyawa antimikrob dan menganalisis keragaman genetiknya berdasarkan amplified ribosomal DNA restriction analysis(ARDRA) dan sekuensing gen 16S rRNA.
Metode untuk mengisolasi bakteri simbion yang diduga memiliki potensi antimikrob dibagi atas dua metode yaitu untuk mengisolasi bakteri dari permukaan dan bagian mesohylJaspis sp. Total jumlah bakteri hasil isolasi dari permukaan dan mesohyl diuji kemampuan antimikrobnya dengan menggunakan bakteri target
Escherichia coli, EPEC K-11, Vibrio harveyi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus dan dua jenis khamir yaitu Candida albicans dan C. tropicalis. Bakteri yang memiliki aktivitas antimikrob dianalisis keragaman genetiknya dengan Amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) serta didentifikasi dengan pewarnaan Gram, uji parsial dan sekuensing gen 16S rRNA.
Hasil isolasi diperoleh 138 isolat bakteri masing-masing 70 isolat endofit dan 68 isolat surfaces, yang ditandai dengan warna dan bentuk koloni yang berbeda-beda. Berdasarkan hasil pengujian antimikrob, 32 isolat bakteri (45,71%) dari total isolat bakteri endofit mempunyai aktivitas antimikrob. Pada bakteri permukaan, 20 isolat bakteri (29,41%) dari total isolat bakteri permukaan juga memiliki aktivitas antimikrob, yaitu mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji namun tidak satupun isolat surfaces mampu menghambatC. albicansdanC.tropicalis. Isolat bakteri yang berada pada bagian mesohyl dan memiliki aktivitas antimikroba yang baik diduga adalah bakteri yang memiliki bentuk assosiasi dengan spons Jaspis sp. yang
berasosiasi dengan cara vertikal transmisi. Isolat bakteri yang berasal dari permukaan dan memiliki aktivitas antimikrob diduga adalah bakteri yang memiliki kemampuan untuk melindungi spons dari patogen, predator danbiofouler.
Meskipun jumlah isolat bakteri yang berasal dari permukaan hampir sama dengan isolat endofit, namun aktivitas antimikrob isolat permukaan lebih rendah dibandingkan isolat endofit. Berdasarkan jumlah isolat yang mempunyai aktivitas antimikrob dan jumlah mikrob target yang dapat dihambat pertumbuhannya, isolat yang berasal dari bagian endofit spons Jaspis sp. lebih banyak dibandingkan isolat yang diisolasi dari permukaan. Bakteri simbion yang berasal dari bagian endofit yaitu mesohyl umumnya memiliki populasi yang berlimpah dan merupakan mikroba spesifik dari spons inangnya. Bakteri simbion yang berasal dari permukaan spons merupakan bakteri yang tidak spesifik dengan inangnya dan memiliki kemiripan dengan komunitas mikrob yang berada di lingkungan perairan dimana spons tersebut berada.
Hasil skrening terhadap semua isolat bakteri yang berasal dari endofit dan permukaan menunjukkan ada enam isolat bakteri yang mampu menghambat pertumbuhan semua mikrob target. Enam isolat tersebut terdiri dari lima isolat endofit yaitu SAB E-8, SAB E-33, SAB E-35, SAB E-38, dan SAB E-40 serta satu isolat permukaan yaitu SAB S-43. Berdasarkan hasil uji antagonis terhadapC. albicans dan
C. tropicalis,hanya isolat SAB E-33, SAB E-38 dan SAB E-40 yang memperlihatkan aktivitas antagonis yang baik. Kemampuan isolat bakteri yang berasosiasi dengan sponsJaspissp. dalam menghambat pertumbuhan mikroba target, merupakan bentuk aktivitas antagonis yang diduga dilakukan dengan menghasilkan kandungan senyawa yang bersifat antimikrobial. Biosintesis senyawa antimikrobial berperan penting dalam proses pelekatan, kolonisasi target hingga kompetisi dalam mendapatkan ruang dan nutrisi dengan mikroba lainnya.
Keragaman genetik dilakukan pada 30 isolat yang memiliki aktivitas antimikrob dilakukan dengan ARDRA. Amplifikasi gen 16S rRNA terhadap 30 isolat yang memiliki aktivitas antimikrob dilakukan dengan menggunakan primer spesifik yaitu 63f dan 1387r. Hasil elektroforesis amplifikasi gen 16S rRNA menampakkan pita yang berukuran sekitar 1300 pb. Primer 63f dan 1387r yang digunakan merupakan primer untuk gen yang menyandikan gen 16S rRNA yang telah didesain untuk seluruh domain bakteri. Primer ini dapat digunakan pada kultur murni bakteri maupun sampel alami dimana gen 16S rRNAnya sulit untuk diamplifikasi. Hasil pemotongan gen 16S rRNA memperlihatkan pola pita gen 16S rRNA yang beragam dengan jumlah 2-4 pita.
Profil pita gen 16S rRNA yang beragam dihasilkan setelah dipotong dengan tiga enzim restriksi yaituRsaI,HaeII dan HinfI. Ketiga enzim restriksi tersebut memiliki situs dan sifat pemotongan yang berbeda-beda. Enzim HinfI merupakan enzim yang memotong secara sticky end, dengan situs pemotongan 5’…G↓ANTC…3’ dan 3’…CTNA↑G…5’. Enzim restriksi RsaI dan HaeIII ialah enzim restriksi yang memotong secarablunt end. Situs pemotongan padaRsaI yaitu 5’…GT↓AC…3’ dan 3’…CA↑TG…5’, sedangkan HaeIII yaitu 5’…GG↓CC…3’ dan 3’…CC↑GG…5’. Konstruksi pohon filogenetik berdasarkan data Amplified ribosomal DNA restriction analysis mengelompokkan 30 isolat asal spons Jaspis sp. yang memiliki aktivitas
pewarnaan Gram dari ke enam isolat terbaik. Isolat SAB E-8, SAB E-35 dan SAB E- 40 dari hasil pewarnaan Gram merupakan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif yaitu isolat SAB E-33, SAB E-38 dan SAB S-43. Uji fisiologis tambahan untuk bakteri Gram positif diarahkan ke kelompok Bacillus dengan melakukan uji parsial yang meliputi pewarnaan Gram, endospora dan katalase. Hasil uji parsial menunjukkan bahwa ketiga isolat tersebut adalah kelompokBacillus, dicirikan oleh sel yang berbentuk batang, pewarnaan Gram positif, terdapat endospora yang terletak pada bagian sentral dan uji katalase positif.
BlastN sekuen gen 16S rRNA enam isolat dengan aktivitas mikrob terbaik, terbagi menjadi dua kelompok filogenetik yang berbeda yaitu genus Pseudomonas
(50%) dan Bacillus (50%). Isolat SAB E-8, SAB E-35, dan SAB E-40 termasuk dalam kelompokPseudomonaskarena ketiga isolat tersebut masing-masing homolog dengan Pseudomonas sp. HN-07, Pseudomonas sp. LPK2 dan Pseudomonas
sp.LD116, dengan tingkat identitas maksimum 97% - 98. Tingkat identitas maksimum 98% - 99% diperoleh dari tingkat homologi isolat SAB E-33, SAB E-38, dan SAB S-43 dengan isolat yang terdapat dalam Gen Bank, yaitu masing-masing
Bacillussp. strain K3,Bacillus pumilusstrain 210-50, danBacillussp.E287.
Pohon filogenetik yang menggunakan data sekuen parsial gen 16S rRNA isolat dengan aktivitas antimikrob terbaik dan beberapa galur acuan (reference strains) menunjukkan adanya kedekatan hubungan kekerabatan. Pohon filogenetik menunjukkan SAB-35 berdekatan secara evolusi dengan Pseudomonas sp. J451 dengan nilai boostrap 56%. Pohon filogenetik menunjukkan SABS-43 dan SABE-33 memiliki kedekatan kekerabatan dengan Bacillus sp. EGU72 sedangkan SAB E-38 denganBacillussp. D203.
Kata kunci : Spons – Asosiasi Bakteri, ARDRA, 16S rRNA, senyawa antimikrob, keragaman genetik
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
KERAGAMAN GENETIKNYA
HERMAWATY ABUBAKAR
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Mayor Mikrobiologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Penelitian : Bakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp.: Analisis Penghasil Senyawa Antimikrob dan Keragaman Genetiknya Nama Mahasiswa : Hermawaty Abubakar
NRP : G351070021
Disetujui, Komisi Pembimbing
Dr. Aris Tri Wahyudi, MSi Dr. Munti Yuhana, MSi
Ketua Anggota
Diketahui,
Koordinator Mayor Mikrobiologi An. Dekan Sekolah Pascasarjana Sekretaris Program S2
Dr.Ir. Gayuh Rahayu Dr.Ir. Naresworo Nugroho, M.Sc.
Puji syukur penulis panjatkan ke Hadirat Allah SWT karena atas segala rahmat dan karuniahNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Topik yang dipilih adalahBakteri yang Berasosiasi dengan Spons Jaspis sp.:Analisis Penghasil Senyawa Antimikrob dan Keragaman Genetiknya, yang dilaksanakan sejak bulan Oktober 2008 sampai Mei 2009.
Penulis menyampaikan penghargaan dan ucapan terima kasih yang sebesar- besarnya terutama kepada pembimbing, yaitu Dr. Aris Tri Wahyudi, Msi. dan Dr. Munti Yuhana, Msi. yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran selama penulis menempuh S2. Terimakasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Dinamella Wahjuningrum, MSi. selaku Penguji Luar Komisi yang telah memberikan koreksi dan arahan untuk perbaikan tesis.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada kedua orang tua, Ayahanda H. Abubakar Makkarumpa dan Ibunda Hj. Bunga Matahari, Suami dan kedua Anakku atas keikhlasan, doa dan kasih sayangnya. Tidak lupa kepada saudara dan sahabat khususnya Ari Susilowati, MSi., Rika I. Astuti, MSi., dan Syamsul Bahri, SSi, penulis mengucapkan banyak terima kasih atas bantuan saran, kritik dan kebersamaanya.
Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih jauh dari sempurna, sehingga kritik dan saran sangat diharapkan. Penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi pembaca.
Bogor, Juli 2009 Penulis
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pinrang propinsi Sulawesi Selatan pada tanggal 5 Agustus 1978 dari pasangan H. Abubakar Makkarumpa dan Hj. Bunga Matahari. Penulis merupakan anak ke empat dari enam bersaudara.
Tahun 1996 penulis lulus dari SMU Muhammadiyah Pinrang dan pada tahun 1997 lulus seleksi masuk Universitas Hasanuddin Makasar pada jurusan Biologi melalui jalur UMPTN dan lulus tahun 2002. Kesempatan untuk melanjutkan ke program Magister Sains pada mayor Mikrobiologi FMIPA-IPB diperoleh pada tahun 2007. Beasiswa diperoleh dari BPPS Departemen Pendidikan Nasional.
Penulis bekerja sebagai tenaga pengajar di Universitas Negeri Papua sejak tahun 2003 sampai sekarang. Pada tahun 2006, penulis menikah dengan Lutfi Amin Mathar dan dikaruniai dua orang putra kembar yang bernama Moch. Rifat Badrani Mathar (Mori) dan Moch. Razan Badrani Mathar (Mora).
DAFTAR TABEL ... xiii DAFTAR GAMBAR ... xiv DAFTAR LAMPIRAN ... xv PENDAHULUAN ... 1 Latar Belakang ... 1 Tujuan ... 3 TINJAUAN PUSTAKA ... 4 Tinjauan Umum Spons ... 4 Asosiasi Spons dengan Bakteri ... 5 Potensi Senyawa Bioaktif dari Assosiasi Bakteri dengan Spons ... 7 Senyawa Antimikrob ... 9
Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis(ARDRA) ... 10 MATERI DAN METODE ... 12 Waktu dan Tempat ... 12 Bahan ... 12 Metode Penelitian ... 12 a. Pengambilan Sampel ... 14 b. Isolasi Bakteri dari Sampel Spons ... 14 c. Penapisan Bakteri Penghasil Senyawa Bioaktif ... 15 d. Pewarnaan Gram dan Uji Parsial ... 16 e. Analisis Molekuler Gen 16S rRNA ... 16 HASIL DAN PEMBAHASAN ... 19 Hasil ... 19 a. Isolasi Bakteri dari Sampel Spons ... 19 b. Penapisan Bakteri Penghasil senyawa Bioaktif ... 19 c. Pewarnaan Gram dan Uji Parsial ... 24 d. Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) ... 26 e. Analisis Sekuens Gen 16S rRNA ... 34 Pembahasan ... 37 a. Isolasi dan Bentuk Asosiasi Spons dengan Bakteri ... 37 b. Isolat Penghasil Senyawa Bioaktif ... 38 c.Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis(ARDRA) ... 41 d. Analisis Sekuens Gen 16S rRNA ... 43 KESIMPULAN ... 46 Kesimpulan ... 46 DAFTAR PUSTAKA ... 47 LAMPIRAN ... 52
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Aktivitas antibakteri dan antikhamir isolat-isolat bakteri endofit asal sponsJaspissp. ... 21 2 Aktivitas antibakteri dan antikhamir isolat-isolat bakteri permukaan
asal sponsJaspissp. ... 23 3 Ukuran fragmen DNA gen 16S rRNA yang dipotong dengan beberapa
enzim restriksi ………... 32
4 Identitas 6 isolat penghasil senyawa antimikrob terbaik yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. berdasarkan sekuens gen 16S rRNA . ………... 35
Halaman
1 Tahapan-tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini ... 13 2 Penampilan spons Jaspis sp., asal perairan sebelah barat Pulau
Waigeo, Raja Ampat Papua Barat ... 14 3 Penampilan koloni bakteri ektosimbion hasil isolasi dari spons Jaspis
sp pada Medium SWC, setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 27oC ...
20
4 Penampilan koloni bakteri endosimbion hasil isolasi dari sponsJaspis
sp pada Medium SWC, setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 27oC ...
20
5 Senyawa Antibakteri yang dihasilkan (terlihat dari zona bening yang terbentuk) dari beberapa isolat bakteri endofit asal spons Jaspis sp. terhadap pertumbuhan bakteri a.S. aureus, b.V. harveyii, c.E. coli, d. EPEC-K11, e.P. aeruginosadan f. S. aureus……….
22
6 Senyawa Antikhamir yang dihasilkan (terlihat dari zona bening yang terbentuk) dari isolat bakteri endofit asal sponsJaspissp. SAB E-35 dan SAB E-38 terhadap pertumbuhan khamir a.C. albicansdan b.C.
tropicalis..……….
22
7 Senyawa Antibakteri yang dihasilkan (terlihat dari zona bening yang terbentuk) dari beberapa bakteri permukaan asal spons Jaspis sp. terhadap pertumbuhan a. S. aureus, b. V. harveyii dan c. P. Aeruginosa...
25
8 Profil koloni pada media SWC dan hasil pewarnaan bakteri Gram negatif isolat SAB E-35 …………...
25 9 Uji parsial genus Bacillus untuk isolat bakteri gram positif (SAB S-
43); Profil koloni pada media SWC; Pewarnaan Gram; Pewarnaan Spora ...………...
25
10 Amplifikasi gen 16S rRNA dari beberapa isolat yang memiliki aktivitas antimikrob terbaik, M: standar ukuran molekul DNA 1kb ladder ………...……….
27
11 Elektroforesis gel agarose gen 16S rRNA dari beberapa isolat bakteri asal spons Jaspis sp. yang mempunyai aktivitas antimikroba terbaik yang dipotong dengan Enzim RsaI (A),HaeIII (B) danHinfI (C). M: standar ukuran molekul DNA (1kb ladder) ...………
28
12 Profil gen 16S rRNA dari 30 isolat bakteri yang berasosiasi dengan sponsJaspissp. yang dipotong dengan enzim restriksiRsaI ………
29 13 Profil gen 16S rRNA dari 30 isolat bakteri yang berasosiasi dengan
sponsJaspissp. yang dipotong dengan enzim restriksiHaeIII ……… 30 14 Profil gen 16S rRNA dari 30 isolat bakteri yang berasosiasi dengan
sponsJaspissp. yang dipotong dengan enzim restriksiHinfI ………
15 Pohon filogenetik (internode rooted) hubungan kekerabatan antar isolat bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. dengan aktivitas antimikrob terbaik yang dianalisis dengan ARDRA dan dikonstruksi berdasarkan metodeNeighbor-Joining. Angka 10% pada bagian atas pohon menunjukkan skala persentase perbedaan (distance scale) antar profil isolat bakteri. Angka pada nodus adalah nilai bootstrap dengan 100 ulangan ...
33
16 Pohon filogenetik berdasarkan hasil sekuensing gen 16S rRNA enam isolat bakteri dengan aktivitas antimikrob terbaik asal sponsJaspissp.
Halaman
1 Komposisi media SWC (Sea Water Complete) ... 51 2 Profil koloni isolat bakteri endofit ... 52 3 Profil koloni isolat bakteri surfaces ... 54 4 Sekuen gen 16S RNA enam isolat terbaik ... 56 5 Hasil perhitungan biner untuk ARDRA ... 59
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mikroorganisme laut merupakan sumber senyawa bioaktif baru yang banyak menjadi perhatian sekarang ini. Bakteri penghuni perairan laut yang miskin nutrisi banyak dijumpai hidup dengan cara berasosiasi dengan berbagai organisme laut bentik, seperti spons dan karang.
Spons merupakan biota laut yang tersebar pada daerah perairan pantai yang dangkal hingga kedalaman 5,5 km. Tubuh hewan ini terdiri dari jaringan rangka yang disebut spikula. Spikula tersebut mengandung senyawa kimia yaitu kalsium karbonat, silika, serat kolagen dan serat spongin yang lentur (Castro & Huber 2005). Spons adalah hewan berpori yang termasuk filter feeder yaitu hewan yang mengumpulkan nutriennya dengan cara menyaring air laut melalui pori-pori (ostium). Makanan porifera berupa sisa organisme yang telah mati atau mikroorganisme yang berada di kolom air. Menurut Tayloret al.(2007), selain dijadikan sumber protein sel tunggal, mikroorganisme juga sebagai simbion dari spons karena mikroorganisme mengkolonisasi tubuh sponge yang berpori-pori sebagai tempat hidup dan berlindung. Hal ini dapat dijumpai sebagai asosiasi antara spons dengan bakteri. Bakteri dapat memberikan kontribusi untuk pertahanan inangnya dengan eksresi antibiotik dan substansi bioaktif lainnya. Secara khusus organisme laut yang sesil seperti spons diperkirakan sangat bergantung pada mekanisme pertahanan simbionnya, yaitu dengan menghasilkan senyawa bioaktif untuk mempertahankan diri terhadap hewan- hewan predator dan dari kolonisasi dari mikroorganisme patogenik.
Banyak senyawa bioaktif yang diproduksi oleh spons sebagai hasil metabolit sekunder. Produk alami laut sebagai hasil metabolik sekunder kemungkinan dihasilkan oleh kehadiran mikroorganisme pada jaringan spons sebagai simbion, baik simbion intraselluler ataupun ekstraselluler. Senyawa-senyawa organik tersebut dapat ditransport oleh adanya kerjasama antara simbion dan inangnya. Kehadiran pasangan simbion ini menjadi syarat untuk menghasilkan metabolik sekunder. Hubungan ini dapat dilihat dari asosiasi spons dan Eubacteria (Barnes 1994).
Jenis senyawa metabolit sekunder yang berhasil diisolasi dari bakteri yang bersimbiosis dengan spons memperlihatkan kuantitas yang lebih banyak dari mikroorganisme laut lainnya. Hal ini terutama dikarenakan kemudahan dalam kultur massalnya. Jenis senyawa metabolit sekunder dari bakteri yang bersimbiosis dengan spons sangat bervariasi yaitu dari golongan terpenoid, alkaloid, polyketida, peptida siklik, derivat dari asam lemak dengan berat molekul kecil, heterosklik, hingga
brominated pyrroles,(Tayloret al.2007).
Vibrio spp. yang berasosiasi dengan spons Dysidea sp menunjukkan adanya sintesis cytotoksik dan antibakteri tetrabromodiphenyl eter demikian pula pada asosiasi antara Micrococcus dengan Tedania ignis ditemukan adanya aktifitas antimikroba (Kanagasabhapathy et al. 2005). Hasil penelitian Kim et al. (2006); Montalvo et.al 2005; Zhang et al. (2006), Actinomyetes yang bersimbiosis dengan spons Pseudoceratina clavalata, Xestospongia spp., Hymeniacidon perlevis dan Craniella australiensisjuga menunjukkan adanya aktifitas antimikrobial.
Penemuan spons sebagai penghasil senyawa bioaktif juga telah banyak dipublikasikan tetapi penggunaan produk alami laut yang bersifat antibiotik dan antifungi sebagai hasil metabolit sekunder dari bakteri yang bersimbiosis dengan spons, lebih menguntungkan dibandingkan dengan mengisolasi dari inangnya. Pertumbuhan spons yang relatif lamban, selanjutnya membawa implikasi pada keterbatasan pasokan biomassa untuk mengekstraksi senyawa metabolit sekundernya. Penggunaan bakteri yang hidupnya berasosiasi dengan spons dalam bentuk simbion lebih baik karena dapat dimurnikan dan dikultur dalam skala laboratorium sehingga tidak perlu mengoleksinya dari alam, dapat diperbanyak dalam waktu yang lebih cepat dan relatif lebih mudah dimanipulasi dengan menggunakan teknologi molekuler. Penggunaan teknik molekuler untuk mengidentifikasi bakteri telah umum dilakukan, salah satunya dengan analisis gen 16S rRNA untuk mengetahui filogeni, penyebaran dan karakteristik bakteri yang bersimbiosis dengan spons. Analisis gen 16S rRNA juga dapat dilanjutkan dengan metode Amplified ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA). Teknik molekuler ini telah banyak digunakan untuk
3
menganalisis komunitas bakteri pada berbagai lingkungan, termasuk spons sebagai simbion dari berbagai bakteri laut.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri yang berasosiasi dengan spons Jaspis sp. (endosimbion dan ektosimbion) penghasil senyawa antimikrob dan menganalisis keragaman genetiknya berdasarkan amplified ribosomal DNA restriction analysis(ARDRA) dan sekuensing gen 16S rRNA.
Tinjauan Umum Spons
Spons (filum Porifera) adalah hewan multisellular (Metazoa) yang paling tua dan mempunyai struktur yang sangat sederhana. Susunan pada struktur spons tidak sama dengan filum yang lainnya, morfologi spons sangat mempengaruhi aspek biologi spons itu sendiri termasuk interaksinya dengan mikroorganisme (Simpson 1984).
Susunan sel-sel spons berbeda pada setiap lapisan strukturnya. Pada permukaan paling luar, atau yang biasa disebut dengan pinacoderm, dibentuk oleh sel-sel epitel yang disebut sebagai pinacocyte. Pori-pori (ostia) pada permukaan luar merupakan saluran yang menembus sampai pada bagian kanal interior. Bagian dalam spons, terdapat sebuah sel-sel berflagella (choanocyte) yang berasal dari sebuah ruang yang disusun oleh choanoderm dimana makanan disimpan.