% Kematian sel
A. 2. Sel SiHa
Sebelum diberi perlakuan, dilakukan persiapan terhadap kultur sel. Sel SiHa ditumbuhkan hingga konfluen dalam medium RPMI 1640. Jumlah sel yang telah konfluen terlihat menempel rapat di dasar flask (Gambar 13.a). Jumlah sel yang telah konfluen selanjutnya dilakukan pemanenan sel, dalam memudahkan pemanenan dan perhitungan sel, media kultur sel dibuang kemudian ditambahkan dengan 100 µl tripsin agar sel lepas dari dasar flask. Sel yang lepas dari dasar sel dan sel yang hidup akan berbentuk bulat–bulat serta terlihat mengapung di permukaan (Gambar 13.b).
commit to user
Gambar 13. Kenampakan morfologi sel SiHa pada perbesaran 100x sebelum pemberian tripsin (a) dan setelah pemberian tripsin (b).
Sel sebelum pemberian tripsin terlebih dahulu dilakukan pencucian dengan PBS yang berfungsi untuk menghilangkan serum dalam media RPMI 1640 yang tertinggal, karena serum ini dapat menghambat kerja tripsin (Freshney, 2000). Tahap selanjutnya, sel yang telah dipanen kemudian dilakukan penambahan medium RPMI 1640 sehingga diperoleh suspensi sel yang dapat langsung dipindahkan ke dalam
microplate.
Variasi konsentrasi yang digunakan pada isolat 4 dan 5 adalah 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625; 7,8125; 3,90625; dan 1,953125 µg/ml. Doxorubicin digunakan sebagai kontrol positif dengan variasi konsentrasi mulai dari 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625; 0,3125; 0,15625; 0,078125; 0,0390625; dan 0,1953125 µg/ml. Kultur sel digunakan sebagai kontrol negatif selain itu digunakan kontrol medium RPMI 1640.
Medium yang berisi sel didistribusikan dalam 96 sumuran masing-masing 100µl, kemudian ditambahkan variasi konsentrasi isolat 4 dan 5 sebanyak 100µl
commit to user
secara triplet. Tahap berikutnya, microplate yang berisi sel dan sampel uji diinkubasi selama 24 jam dan dilakukan pengamatan selanjutnya.
Setelah dilakukan inkubasi selama 24 jam, sel kemudian diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x maka akan terlihat adanya perubahan morfologi sel. Seperti halnya pada sel HeLa, sel yang mati akan terlihat adanya perubahan bentuk, sel berwarna keruh dan mengapung.
Morfologi sel SiHa setiap perlakuan secara lengkap tersaji pada Lampiran 6. Penetapan jumlah sel yang mati dan hidup pada pengujian sitotoksisitas dapat dilakukan dengan berbagai cara. Penetapan yang dilakukan berdasarkan pada parameter kerusakan membran, gangguan sintesis dan degradasi makromolekul, modifikasi kapasitas metabolisme, serta perubahan morfologi sel. Petunjuk toksisitas berdasarkan adanya kerusakan membran meliputi perhitungan sel yang mengambil (up take) atau tidak bahan pewarna seperti biru tripan. Perubahan morfologi dapat diketahui dengan mikroskop electron (Snell dan Mullock, 1987 dalam Rahmawati, 2004).
Berdasarkan metode MTT, sel yang hidup akan membentuk kristal formazan seperti yang terlihat pada Gambar 14. Formazan merupakan zat berwarna ungu yang tidak larut dalam air sehingga dilarutkan menggunakan HCl 0,04 N dalam isopropanol atau 10% SDS. Intensitas warna ungu yang terbentuk dapat ditetapkan dengan spektrofotometri dan berkorelasi langsung dengan jumlah sel yang aktif
commit to user
melakukan metabolisme, sehingga berkorelasi dengan viabilitas sel. Reaksi pembentukan kristal formazan tersaji pada Gambar 15.
Gambar 14. Kenampakan sel hidup yang membentuk kristal formazan, (1) sel hidup, (2) sel mati.
Gambar 15. Reaksi MTT menjadi formazan (Mosmann, 1983)
Reduksi MTT menjadi garam formazan terjadi jika enzim reduktase dalam mitokondria dalam keadaan aktif. Reduksi dalam sel melibatkan reaksi enzimatik dengan NADH atau NADPH yang dihasilkan oleh sel hidup sehingga menghasilkan endapan yang tidak larut. Pemecahan MTT terjadi pada mitokondria sel yang hidup oleh enzim suksinat dehidrogenase. Absorbansi yang dihasilkan sebanding dengan konsentrasi biru formazan yang larut dalam SDS. Reduksi garam tetrazolium merupakan cara yang dapat dipercaya untuk mendeterminasikan proliferasi sel. Garam tetrazolium MTT yang berwarna kuning berkurang sebagai akibat dari
1
2
Mitokondria reduktase
commit to user
aktivitas metabolisme sel terutama oleh kerja enzim suksinat dehidrogenase (Mosmann, 1983).
Konsentrasi yang diujikan pada sel SiHa dimulai dari 1000 µg/ml karena sebelumnya telah dilakukan uji pendahuluan mulai konsentrasi 200 µg/ml untuk isolat 4 dan 5, namun hasilnya menunjukkan persentase kematian sel belum mencapai 50%, oleh karena itu konsentrasi dinaikkan hingga memperoleh 50% kematian. Persentase kematian pada sel SiHa dapat dilihat pada Tabel 3, sedangkan nilai absorbansi secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 7.
Tabel 3. Persentase kematian sel SiHa setelah perlakuan dengan isolat 4 dan 5
Konsentrasi (µg/ml) Rata- rata absorbansi % kematian Isolat 4 1000 1.053 31.904 500 1.123 25.467 250 1.128 24.974 125 1.134 24.451 62.5 1.181 20.078 31.25 1.275 11.423 15.625 1.300 9.085 7.8125 1.324 6.896 3.90625 1.372 2.430 1.953125 1.375 2.137 Isolat 5 1000 1.097 27.869 500 1.126 25.190 250 1.127 25.067 125 1.147 23.281 62.5 1.192 19.046 31.25 1.225 16.012 15.625 1.251 13.597 7.8125 1.305 8.651 3.90625 1.35 4.493 1.953125 1.481 -7.610
commit to user
Berdasarkan hasil pada Tabel 3 persentase kematian hingga konsentrasi 1000 µg/ml baik isolat 4 dan 5 belum menunjukkan 50% kematian. Padahal konsentrasi >1000 µg/ml suatu senyawa dapat dikatakan tidak toksik, karena semakin besar nilai
IC50-24 jam maka senyawa tersebut semakin tidak toksik. Jadi dapat dikatakan bahwa
isolat 4 dan 5 tidak toksik pada sel SiHa.
Hal ini juga dapat dilihat pada Gambar 16 terlihat bahwa hingga konsentrasi 1000µg/ml masih banyak sel yang hidup.
Gambar 16. Kenampakan morfologi sel SiHa pada perbesaran 100x setelah penambahan isolat rumput mutiara pada perlakuan (a) isolat 4 (konsentrasi 1000 µg/ml), (b) isolat 5 (konsentrasi 1000 µg/ml), (c) doxorubixin konsentrasi 10 µg/ml, (d) kontrol sel.
Keterangan: (1) sel hidup, (2) sel mati
(a) 2 1 (b) 2 1 (c) 2 (d) 1
commit to user
B. Mekanisme Penghambatan Isolat
Adanya perbedaan ketoksikan isolat 4 dan 5 pada sel HeLa dimungkinkan karena adanya perbedaan kandungan dalam masing-masing senyawa tersebut. Ruwaida (2010) melaporkan bahwa isolat 4 belum dapat diketahui golongan senyawanya, sedangkan isolat 5 diidentifikasi merupakan senyawa golongan terpenoid.Profil KLT terhadap kandungan isolat 4 dan 5 tersaji pada Gambar 17.
Gambar 17. Profil kromatogram isolat 4 dan 5 rumput mutiara dengan pereaksi deteksi semprot vanillin-asam sulfat, isolat 4 (1), isolat 5 (2). Ruwaida (2010) melaporkan bahwa dalam isolat 5 terdapat senyawa golongan terpenoid dengan adanya bercak warna biru pada Rf 0,81 (Gambar 17). Deteksi dengan pereaksi semprot valinin-asam sulfat akan menunjukkan hasil positif adanya terpenoid bila terdapat bercak berwarna antara biru sampai ungu. Namun sebaliknya isolat 4 menunjukkan hasil yang negatif pada pereaksi tersebut. Pengujian lebih lanjut
1 Rf 0.75 0 0.25 0.5 (Ruwaida, 2010).
commit to user
terhadap isolat 5 membuktikan bahwa isolat 5 bukan senyawa ursolic acid
berdasarkan metode KLT.
Adanya perbedaan kandungan senyawa tersebut juga akan mempengaruhi ketoksikan pada sel kanker. Salah satu golongan terpenoid yaitu monoterpen, dilaporkan mempunyai aktivitas antitumor, salah satu diantaranya yaitu limonen. Senyawa ini mempunyai kemampuan kemoprevensi pada beberapa tipe kanker. Mekanisme aksi dari monoterpenoid yaitu dengan cara memblok dan menekan aktivitas tumor (Crowell, 1999). Contoh lainnya, taxol merupakan senyawa golongan diterpen dari tanaman Taxus brevifolia yang telah digunakan secara luas untuk pengobatan kanker serviks dan kanker payudara. Mekanisme aksi antikanker taxol yaitu dengan cara menstabilkan tubulin sehingga mencegah terjadinya pembelahan sel (Artanti et al., 2005). Taxol diketahui mampu menghambat mitosis dengan cara menyebabkan kerusakan pada mikrotubul, karena menghalangi terbentuknya mikrotubul sehingga akan terjadi pengeblokan pada proses mitosis (Lesney, 2004).
Hal lain yang dapat menyebabkan adanya perbedaan ketoksikan suatu senyawa terhadap sel yaitu adanya molekut target yang berbeda pada setiap sel kanker. Sebagai contoh yaitu fitosterol, senyawa ini merupakan steroid dalam golongan triterpen dan mempunyai struktur yang mirip dengan kolesterol (Gambar 18).
commit to user
(a) (b) (Awad dan Carol, 2000) Gambar 18. Struktur senyawa (a) β-sitosterol dan (b) 3β-hidroksi kolesterol. Bentuk fitosterol yang umum yaitu β-sitosterol, campesterol dan stigmasterol. Adanya kemiripan struktur membran molekul target sehingga memudahkan senyawa tersebut untuk melewati membran sel (Awad dan Fink, 2000). Adanya kemudahan senyawa dalam melewati struktur membran ini dapat dianalogkan seperti model gembok-kunci (lock-key), hal ini menyebabkan senyawa tersebut akan lebih mudah masuk dan mempengaruhi aktivitas yang terjadi di dalam sel. Struktur membran sel tersaji dalam Gambar 19.
Gambar 19. Struktur membran sel (Sheeler, 1983).
Plasma membran glikoprotein
glikolipid
Protein reseptor
commit to user
Faktor lain yang dapat menyebabkan adanya perbedaan kemampuan isolat 4 dan 5 terhadap sel HeLa dan SiHa karena adanya faktor yang berbeda yang menyebabkan kedua sel kanker tersebut. Sel HeLa merupakan sel kanker serviks yang disebabkan oleh HPV (Human Papilloma Virus)18 sedangkan SiHa oleh HPV 16. Perbedaan potensi berbagai tipe HPV terhadap karsinogenesis tergantung dari
afinitas protein E6 dalam mengikat gen p53 dan protein E7 dalam mengikat protein
Rb. Protein E6 dari HPV 18 dan HPV 16 akan mengakibatkan inaktivasi gen p53
melalui mekanisme pengikatan yang disebut ubiquitin-dependent proteolytic pathway
(E6AP), sehingga akan terjadi penurunan kadar gen p53. Hal ini menyebabkan gen p53 tidak dapat bekerja secara normal sehingga akan terdegradasi (Gambar 20) (Lagrange et al., 2005).
commit to user
Disisi lain adanya pengikatan protein E7 terhadap pRb, akan menyebabkan hal yang sama seperti pada gen p53. Ikatan E7 dengan pRb tersebut menyebabkan tidak terikatnya gen E27 (faktor transkripsi) oleh pRb (Gambar 21). Tidak adanya pengikatan gen E2F menyebabkan gen tersebut menjadi aktif dan akan membantu c-myc untuk terjadinya replikasi DNA dan menstimulasi siklus sel (Prayitno et al., 2005).
Gambar 21. Mekanisme pengikatan E7 terhadap protein Rb (Prayitno et al., 2005). Contoh lain yaitu penelitian yang dilakukan oleh Sukardiman et al. (2005) melaporkan bahwa senyawa andrograpolida dari tanaman sambiloto mampu mematikan atau menginduksi sel HeLa dengan IC50 sebesar 109.90 µg/ml. Andrograpolida merupakan senyawa diterpen yang mempunyai aktivitas sebagai inhibitor terhadap aktivitas enzim DNA topoisomerase II. Fungsi enzim DNA topoisomerase mempunyai peran yang sangat penting dalam proses replikasi, transkripsi, rekombinasi DNA dan proses proliferasi dari sel kanker. Oleh karena itu
commit to user
akan menyebabkan proses terjadinya ikatan antara enzim dengan DNA sel kanker semakin lama, sehingga akan terbentuk Protein Linked DNA Breaks (PLDB), akibatnya terjadi fragmentasi atau kerusakan DNA sel kanker dan selanjutnya berpengaruh terhadap proses di dalam sel secara apoptosis.
Penelitian yang serupa juga dilakukan oleh Jamora et al. (2001) yaitu dengan melakukan isolasi terhadap senyawa diterpen dari jamur yaitu senyawa clerocidin yang telah diketahui memiliki aktivitas sebagai inhibitor enzim DNA topoisomerase II. Hasil penelitian menyatakan bahwa senyawa clerocidin memiliki aktivitas apoptosis terhadap sel HeLa. Miao et al. (2003) juga melakukan uji induksi senyawa diterpenoid kuinon salvicina yang juga diketahui memiliki aktivitas sebagai inhibitor enzim DNA topoisomerase II dan hasil penelitiannya menyebutkan bahwa senyawa salvicina mampu membunuh sel kanker MDR (Multi Drug Resistant) dengan mekanisme apoptosis. Adanya berbagai mekanisme aksi pada masing-masing tipe terpenoid, maka diperlukan pengujian lebih lanjut untuk mengetahui terpen dari isolat 5. Akan tetapi untuk mengetahui mekanisme penghambatan pertumbuhan pada sel HeLa maupun SiHa dapat dilakukan dengan pengujian lebih lanjut melalui
mechanism-based assay. Hal ini dapat dilakukan dengan cara pengamatan apoptosis dengan menggunakan metode doublestainning menggunakan etidium bromide-acrydine orange, sel yang hidup akan berflouresensi hijau karena hanya menyerap
commit to user
bromide mampu melewati membran. Hal ini sebagai penanda bahwa sel yang mati telah kehilangan permeabilitas membrannya (Meiyanto et al., 2008)
Salah satu obat antikanker yang banyak terdapat di pasaran adalah doxorubisin. Doxorubisin merupakan agen kemoterapi golongan antrasiklin yang memiliki aktivitas antikanker spektrum luas dan telah lama digunakan pada berbagai jenis kanker. Senyawa ini mempunyai aktivitas antikanker dan spesifik untuk fase S dalam siklus sel. Rock dan De Michele (2003) menerangkan bahwa mekanisme aksi doxorubisin kemungkinan melibatkan ikatan dengan DNA melalui interkalasi diantara pasangan basa serta menghambat sintesis DNA dan RNA melalui pengacauan template. Kemungkinan mekanisme yang lain adalah dengan melibatkan ikatan dengan lipid membran sel yang akan mengubah berbagai fungsi seluler dan berinteraksi dengan DNA topoisomerase II membentuk komplek pemotongan DNA.
Namun penggunaan doxorubisin sebagai agen kemoterapi dibatasi oleh efek toksik terhadap jaringan normal terutama jantung dan mampu menekan sistem imun (Wattanapiyakul et al., 2005). Oleh karena itu terus dilakukan upaya pencarian senyawa aktif dari bahan alam. Berdasarkan nilai IC50-24 jam isolat 5 pada sel HeLa yaitu sebesar 88.10 µg/ml, maka isolat 5 dapat diperhitungkan sebagai salah satu alternatif senyawa antikanker. Penggunaan senyawa antikanker dari bahan alam dapat dikombinasikan dengan obat antikanker secara sinergis dan diharapkan dapat meningkatkan sensitifitas sel terhadap doxorubisin. Sebagai contohnya yaitu sel MCF-7 merupakan salah satu sel kanker payudara yang resisten terhadap agen
commit to user
kemoterapi, akan tetapi kombinasi penggunaan doxorubisin dengan fraksi butanolik kapang endofit buah makasar mampu meningkatkan sensitifitas sel MCF-7 terhadap doxorubisin sehingga memperkuat pemacuan apoptosis sel MCF-7. Penggunaan tunggal fraksi butanolik tersebut mempunyai IC50-24 jam 48 µg/ml dan 148 nM pada doxorubisin, akan tetapi sinergisme fraksi butanolik tersebut dengan doxorubisin terlihat dari nilai CI (Indeks Combinasi) <0,9 (Kumala et al., 2009). Oleh karena itu penggunaan kombinasi antara senyawa antikanker dari bahan alam dengan obat antikanker merupakan salah satu alternatif pengobatan saat ini.
commit to user BAB V