4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.4 Senyawa Fitokimia
Uji fitokimia dilakukan terhadap ekstrak yang menunjukkan aktivitas antibakteri terbaik pada uji sebelumnya, yaitu ekstrak etil asetat hasil maserasi bertingkat. Pengujian fitokimia dilakukan untuk menentukan senyawa yang bertanggung jawab atas aktivitas antibakteri pada ekstrak etil asetat kulit batang api-api. Senyawa bioaktif yang diuji hanya terbatas pada senyawa yang berpotensi memiliki aktivitas antimikroba yaitu alkaloid, steroid/triterpenoid, flavonoid, fenol hidrokuinon, saponin dan tanin. Hasil uji fitokimia dapat dilihat pada Tabel 3 dan Lampiran 3.
Tabel 3. Hasil identifikasi kandungan fitokimia ekstrak etil asetat kulit batang api- api (A. marina) hasil maserasi bertingkat
Uji fitokimia Hasil uji (warna)
Keterangan Standar (warna)
a. Alkaloid Wagner Meyer Dragendorff (-) (-) (-) Tidak terbentuk endapan Endapan cokelat
Endapan putih kekuningan Endapan merah sampai jingga
b. Steroid/Triterpenoid (+) Biru Merah menjadi biru atau hijau
c. Flavonoid (-) Hijau (ekstrak
tidak larut)
Merah, kuning/jingga pada lapisan amil alkohol
d. Saponin (-) Tidak terbentuk
busa
Terbentuk busa stabil selama 30 menit
e. Fenol hidrokuinon (+) Kehijauan Hijau / hijau biru
f. Tanin (-) Jingga Biru kehitaman
Keterangan (+) : terdeteksi (-) : tidak terdeteksi
Tabel 3 menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat kulit batang api-api hasil maserasi bertingkat memiliki kandungan senyawa steroid/triterpenoid dan fenol. Steroid/triterpenoid positif berada dalam ekstrak etil asetat, dilihat dari kepekatan warna hijau yang terbentuk. Uji penentuan senyawa steroid dan triterpenoid didasarkan pada reaksi Liebermann-Burchard, dimana warna hijau atau biru akan terbentuk jika terdapat senyawa tersebut. Fenol hidrokuinon terdapat pada ekstrak etil asetat, ditunjukkan dengan warna kehijauan. Keberadaan senyawa fenol dan
steroid/triterpenoid pada ekstrak etil asetat mengindikasikan bahwa kedua senyawa tersebut berperan dalam aktivitas antimikroba.
Terpenoid terdiri atas beberapa macam senyawa mulai dari komponen minyak atsiri yaitu monoterpena dan seskuiterpena yang mudah menguap, diterpena yang lebih sukar menguap, hingga senyawa yang tidak menguap yaitu triterpenoid dan sterol. Triterpenoid dapat dipilah menjadi triterpena sebenarnya, steroid, saponin dan glikosida jantung. Steroid merupakan salah satu kelompok senyawa dari triterpenoid. Steroid adalah senyawa yang berbentuk padatan kristal yang memiliki warna putih dan dapat berbentuk jarum kecil, lembaran, lempengan atau partikel amorf tergantung pelarut yang digunakan dalam proses kristalisasi (Harborne 1987).
Beberapa penelitian sebelumnya sudah menunjukkan adanya senyawa steroid dan triterpenoid pada tumbuhan api-api (A. marina). Zhu et al. (2009) melaporkan bahwa steroid dan triterpenoid ditemukan pada kulit batang, daun, bunga dan buah A. marina. Penelitian yang dilakukan oleh Yusuf (2010) berhasil mengisolasi dan menentukan struktur molekul senyawa triterpenoid dari kulit batang api-api. Ravikumar et al. (2011) pada penelitiannya tentang antimikroba, menyatakan bahwa A. marina mengandung terpenoid.
Senyawa triterpenoid dan steroid dalam ekstrak etil asetat kulit batang api- api diduga memiliki aktivitas antimikroba. Pernyataan ini didukung oleh Kiplimo et al. (2011) yang melaporkan aktivitas antimikroba dari senyawa triterpenoid terhadap beberapa jenis bakteri.
Senyawa triterpenoid dan steroid diketahui memiliki aktivitas antimikroba (Doughari 2012). Mekanisme aksi senyawa triterpenoid terutama adalah mengganggu kekuatan membran sel fungi (Ahmad et al. 2010). Triterpenoid dapat menyebabkan kerusakan integritas membran dengan cara membentuk komplek dengan sterol pada membran fungi (Dudek 1950). Menurut Cowan (1999), mekanisme penghambatan bakteri oleh senyawa steroid/triterpenoid diduga dengan cara merusak membran sel bakteri.
Fenol merupakan metabolit sekunder dari tumbuhan yang cenderung mudah larut air. Hal tersebut disebabkan oleh fenol yang sering berikatan dengan gula sebagai glikosida. Beberapa golongan bahan polimer penting dalam
tumbuhan seperti tanin adalah senyawa polifenol dan kadang satuan fenolik dijumpai pada protein, alkaloid dan diantara terpenoid (Harborne 1987). Bandaranayake (2002) menyebutkan bahwa senyawa fenolik dapat ditemukan pada mangrove, termasuk pada A. marina.
Senyawa aktif lain yang mendukung kemampuan antibakteri ekstrak etil asetat pada penelitian ini yaitu senyawa fenolik. Senyawa fenolik terbukti memiliki aktivitas antimikroba. Pernyataan ini didukung oleh penelitian Haq et al. (2011) yang mengekstrak senyawa fenolik dari Bruguiera gymnorrhiza, fenol terbukti memiliki aktivitas antioksidan dan antimikroba.
Senyawa fenol mampu mengkoagulasikan protein dan merusak membran sel dengan cara menurunkan tegangannya (Waluyo 2008). Cowan (1999) melaporkan bahwa mekanisme aktivitas antimikroba dari fenol meliputi adsorpsi dan gangguan pada membran mikroba, interaksi dengan enzim dan substrat, serta penghilangan besi. Maris (1995) menyatakan bahwa fenol bekerja secara spesifik pada membran sel dan enzim intrasitoplasma dengan cara membentuk kompleks yang tidak stabil.
Salah satu target penting dari senyawa antibakteri adalah dinding sel (Brock dan Madigan 1991). Kemampuan fenol dalam mengendapkan atau mendenaturasi protein dapat menggangu dinding sel bakteri yang tersusun dari
protein. Komponen utama dinding sel bakteri adalah peptidoglikan (Pelczar dan Chan 1986).
Alkaloid adalah salah satu kelompok metabolit sekunder yang paling penting berdasarkan jumlahnya pada tumbuhan dan aktivitas farmakologinya. Umumnya alkaloid mencakup senyawa bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen, biasanya merupakan bagian dari sistem siklik. Banyak alkaloid bersifat terpenoid (Harborne 1987). Menurut Perez-Amador et al. (2007) senyawa ini tersebar luas pada tumbuhan yang dipengaruhi oleh lokasi tumbuh tanaman dan kondisi lingkungan. Ravikumar et al. (2011) menemukan ekstrak etanol daun A. marina mengandung alkaloid. Pada penelitian ini, senyawa alkaloid tidak terdeteksi. Hal ini mengindikasikan bahwa pada senyawa alkaloid tidak larut pada etil asetat.
Flavonoid umumnya terdapat pada tumbuhan, terikat pada gula sebagai glikosida. Flavonoid terdapat dalam tumbuhan sebagai campuran, jarang sekali dijumpai hanya flavonoid tunggal dalam jaringan tumbuhan (Harborne 1987). Pada penelitian Ravikumar et al. (2011) ditemukan bahwa flavonoid terkandung dalam jumlah banyak pada ekstrak etanol daun A. marina, namun pada penelitian ini tidak terdeteksi. Flavonoid bersifat larut air sehingga diduga kelarutannya kecil dalam etil asetat (semi-polar) yang mengakibatkan tidak terdeteksinya senyawa ini pada ekstrak etil asetat kulit batang api-api hasil maserasi bertingkat.
Saponin merupakan senyawa aktif permukaan dan bersifat seperti sabun, serta dapat dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa dan menghemolisis sel darah (Harborne 1987). Menurut Francis et al. (2001) nama saponin berasal dari kemampuannya untuk berbentuk busa mirip sabun yang stabil dalam larutan encer. Pada uji fitokimia (Tabel 3) tidak terdeteksi senyawa saponin dalam ekstrak etil asetat kulit batang api-api hasil maserasi bertingkat yang ditandai dengan tidak terbentuknya busa pada larutan. Hasil serupa didapat oleh Abeysinghe et al. (2006) yang melaporkan tidak ditemukannya saponin pada ekstrak daun A. marina.
Menurut Cowan (1999), tanin secara umum ditemukan pada semua bagian tumbuhan. Tanin dibagi dalam dua kelompok yaitu tanin hidrolisis dan tanin kondensasi. Clinton (2009) menyatakan bahwa tanin memiliki fungsi perlindungan pada kulit di batang dan akar, atau lapisan luar lain pada tumbuhan. Senyawa ini membentuk kompleks yang kuat dengan protein, pati dan makromolekul lain.
Tumbuhan mangrove diketahui memiliki kandungan tanin yang tinggi, hal ini didukung oleh penelitian Hong et al. (2011) yang mengekstrak tanin hidrolisis dari mangrove Rhizopora apiculata. Senyawa tanin tidak terdeteksi dalam ekstrak etil asetat kulit batang api-api hasil maserasi bertingkat pada uji fitokimia.
Penggunaan jaringan kering untuk ekstraksi tanin akan menyebabkan hasil tanin yang agak berkurang karena terjadinya pelekatan tanin pada tempatnya di dalam sel. Umumnya tanin dapat terekstrak dengan asam panas (Harborne 1987). Pengeringan kulit batang api-api sebelum ekstraksi pada penelitian ini
menyebabkan senyawa tanin melekat pada jaringan sehingga sulit terekstrak oleh etil asetat pada suhu ruang yang menyebabkan senyawa tanin tidak terdeteksi. 4.5 Kandungan Total Fenol
Fenol pada awalnya digunakan sebagi germisida pada ruang bedah untuk mencegah timbulnya infeksi paskabedah. Pada konsentrasi yang rendah (2-4%), daya bunuhnya disebabkan fenol mempresipitasikan protein secara aktif dan merusak membran sel dengan cara menurunkan tegangan permukaannya. Fenol merupakan standar pembanding untuk menentukan aktivitas atau khasiat dari suatu desinfektan (Waluyo 2008).
Pengetahuan mengenai kandungan fenol yang ada pada kulit api-api sangat penting karena fenol merupakan salah satu senyawa yang memiliki aktivitas antimikroba. Pengujian senyawa fitokimia ekstrak terpilih yaitu ekstrak etil asetat dari hasil maserasi bertingkat menunjukkan adanya senyawa fenol hidrokuinon sehingga dilakukan uji total fenol untuk mengetahui kuantitas dari senyawa fenol yang terdapat pada ekstrak etil asetat hasil maserasi bertingkat. Total fenol diuji menggunakan metode Follin-Ciocalteu dengan standar asam galat. Total fenol yang terkandung pada ekstrak yang diuji dihitung berdasarkan standar asam galat dan disajikan dalam ekuivalen asam galat (GAE) per gram sampel kering. Kurva standar asam galat dapat dilihat pada Lampiran 3.
Nilai total fenol diperoleh dari pengukuran nilai absorban dan perhitungan menggunakan persamaan regeresi linear asam galat. Kandungan total fenol yang terdapat pada ekstrak etil asetat kulit batang api-api yang dimaserasi secara bertingkat sebesar 177,023 mg GAE/1000 g sampel. Nilai ini lebih sedikit bila dibandingkan penelitian terhadap kulit batang mangrove sebelumnya yang dilakukan oleh Haq et al. (2011). Pada penelitian tersebut, total fenol ekstrak metanol kulit batang Bruguiera gymnorhiza sebesar 268,47 mg GAE/g sampel. Hal ini diduga disebabkan oleh senyawa fenol yang lebih larut pada metanol. Fenol cenderung larut pada pelarut polar (Harborne 1987).
Menurut Maris (1995) fenol bekerja secara spesifik pada membran sel, dan menginaktifkan enzim intrasitoplasma dengan cara membentuk kompleks tak stabil. Molekul lipofilik akan terperangkap pada membran fosfolipid. Proses
tersebut meliputi pelepasan komponen sel ke lingkungan, mendenaturasi protein bakteri dan memecah membran sel.
Fenol menyerang lapis batas sel dan merusak semipermeabilitas membran sitoplasma (Schlegel dan Schmidt 1994). Pada konsentrasi tinggi, fenol dengan cepat merusak dinding sel dan membran, serta mengendapkan protein. Senyawa fenol pada konsentrasi rendah akan menginaktifkan sistem enzim tertentu (Cowan dan Talaro 2009).