PENELAAHAN PUSTAKA
B. Spektrofotometri Ultraviolet
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi, spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi panjang gelombang (Khopkar, 2008). Bila cahaya (monokromatik maupun campuran) jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk akan dipantulkan sebagian diserap medium itu, dan sisanya diteruskan (Basset, dkk., 1994).
Radiasi elektromagnetik pada sinar ultraviolet dan sinar tampak (visibel) dianggap sebagai energi yang merambat dalam bentuk gelombang. Panjang gelombang merupakan jarak linier dari suatu titik pada satu gelombang ke titik yang bersebelahan pada gelombang yang berdekatan (Watson, 2003).
Sinar ultraviolet dan sinar tampak memberikan energi yang cukup untuk terjadinya transisi elektronik, maka spektra ultraviolet dan tampak dikatakan sebagai spektra elektronik. Prinsip kerja spektrofotometri Uv-Vis berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan atom, ion, atau molekul. Serapan atom menyebabkan peralihan atau transisi elektronik, yaitu peningkatan energi elektron dari keadaan dasar (ground state) ke satu atau lebih tingkat energi yang lebih tinggi atau tereksitasi (excited state). Transisi terjadi jika energi yang dihasilkan oleh radiasi sama dengan energi yang diperlukan untuk melakukan transisi (Watson, 2003).
Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual, yang dengan studi lebih mendalam dari absorpsi energi radiasi oleh macam-macam zat kimia sehingga dilakukannya pengukuran ciri-ciri serta kuantitatifnya dengan ketelitian yang lebih besar (Day dan Underwood, 1983). Dalam aspek kuantitatif spektrofotometer Uv-Vis, suatu radiasi dikenakan pada larutan (sampel) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya. Radiasi yang diserap oleh sampel (Gambar 3) ditentukan dengan membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan yang diserap. Serapan terjadi jika radiasi/foton yang mengenai sampel memiliki energi yang sama dengan energi yang diperlukan untuk perubahan tenaga. Kekuatan radiasi dapat mengalami penurunan dengan adanya penghamburan dan pemantulan cahaya (Sudjaji dan Rohman, 2007).
Gambar 3. Penyerapan sinar UV oleh larutan (Watson, 2003)
Perhitungan besarnya serapan cahaya oleh suatu molekul dalam larutan mengikuti Hukum Lambert-Beer dengan rumus:
Log I0/It = A = ε b c (1) I0 adalah intensitas sinar awal; It adalah intensitas sinar setelah melalui larutan dengan ketebalan b; A adalah absorbansi terukur (besarnya/sejumlah cahaya
Sampel
yang diserap oleh sampel); ε adalah konstanta serapan tiap 1M analit dalam larutan; b adalah ketebalan kuvet (biasanya 1cm); dan c adalah konsentrasi analit (Watson, 2003).
Hubungan antara nilai A % cm dengan absorptivitas molar (ε) adalah:
ε = A % cm x BM (2) Keterangan:
Ε = absorptivitas molar
% = absorptivitas molekul dalam satuan konsentrasi (g/100 mL) BM = bobot molekul
(Sudjaji dan Rohman, 2007). Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa instensitas yang diteruskan oleh larutan zat penyerap sebanding dengan tebal dan konsentrasi larutan. Dalam hukum ini terdapat pembatasan yaitu: sinar yang digunakan dianggap monokromatis; tidak terjadi fluoresensi atau fosforesensi; indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan; penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang luas sama; dan senyawa yang menyerap tidak tergantung kepada senyawa lain dalam larutan (Sudjaji dan Rohman, 2007).
Instrumen yang digunakan untuk mempelajari serapan atau emisi radiasi elektromagnetik sebagai fungsi panjang gelombang disebut spektrofotometer. Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer (Gambar 4) meliputi: (1) sumber tenaga radiasi (stabil), (2) sistem yang terdiri atas lensa-lensa, cermin, dan celah, (3) monokromator untuk mengubah radiasi menjadi komponen-komponen panjang gelombang tunggal, (4) tempat cuplikan (transparan), dan (5) detektor radiasi yang dihubungkan dengan pencatat (Sastrohamidjojo, 2001).
Gambar 4. Gambar skematis spektrofotometer UV-Vis (Watson, 2003) Sumber energi pada spektrofotometer harus dapat memberikan intenitas radiasi elektromagnetik secara stabil pada daerah spektrum elektromagnetik. Sumber energi dibagi menjadi dua yaitu sumber energi continuum dan sumber energi line. Sumber energi continuum merupakan sumber energi yang memancarkan lebih dari satu panjang gelombang dengan intensitas bervariasi dari masing-masing panjang gelombang. Sumber energi line merupakan sumber energi yang memancarkan satu panjang gelombang yang selektif. Pada spektrofotometer Uv-Vis menggunakan sumber energi continuum, sehingga membutuhkan monokromator sebagai selektor filter untuk membatasi jumlah panjang gelombang radiasi elektromagnetik yang akan masuk (Harvey, 2000).
Panjang gelombang radiasi yang masuk melalui monokromator akan melewati sampel. Pada saat panjang gelombang radiasi melewati sampel, akan terjadi pengurangan sejumlah radiasi, sehingga panjang gelombang radiasi yang keluar ditangkap oleh detektor akan lebih kecil dari panjang gelombang radiasi
Slit Slit Monokromator Detektor Sampel dalam kuvet kuarsa Lampu deuterium dan
yang masuk. Banyaknya jumlah radiasi yang berkurang berbanding lurus dengan konsentrasi analit dalam sampel (Harvey, 2000).
C. Kemometrika
Permasalahan dalam analisis senyawa multikomponen secara simultan dengan menggunakan metode spektrofotometri adalah adanya overlapping spektra satu senyawa dengan senyawa lainnya (Ragno et al., 2004). Analisis masing-masing komponen senyawa dalam campuran yang mempunyai spektra overlapping
hanya dapat diatasi dengan metode pemisahan secara kromatografi atau metode spektrofotometri yang dikombinasikan dengan kalibrasi multivariat (Miller & Miller, 2010).
Kemometrika adalah ilmu pengetahuan yang menghubungkan pengukuran yang dibuat pada suatu proses atau sistem kimiawi melalui penggunaan ilmu matematika dan statistika (Rohman, 2014). Kemometrika berfokus pada ekstraksi informasi yang relevan dari data kimiawi dengan memanfaatkan ilmu matematika dan statistika (Kurt, 2009). Kemometrika banyak berkaitan dengan pengukuran data multivariat. Data multivariat adalah data yang dihasilkan dari pengukuran banyak variabel pada satu sampel yang sama (Rohman, 2014). Uji statistik multivariat merupakan alat yang sangat baik digunakan untuk menganalisis data yang diperoleh dari suatu pengukuran kimia dan untuk membuat suatu model matematika empirik untuk secara instan dapat memprediksi suatu nilai yang tidak dapat diukur secara langsung (Kurt, 2009).
Tiap data dikarakterisasi dengan serangkaian pengukuran. Jika hanya dua variabel yang terukur maka informasinya dapat disajikan secara grafik sederhana
yang mana koordinat-koordinat titik memberikan suatu nilai oleh 2 variabel. Nilai– nilai tersebut dapat ditentukan sebagai suatu vektor. Data yang mempunyai sifat serupa akan mempunyai vektor yang sama sehingga data-data ini akan terletak secara rapat satu sama lain dalam suatu ruang yang ditentukan dengan beberapa variabel (Rohman, 2014).
Metode-metode kemometrika adalah metode yang dipergunakan untuk mereduksi data dan mengelompokkan data-data tersebut dalam suatu kelompok dengan karakter data yang sama. Dalam hal ini, ada dua jenis cara pengelompokkan yakni: (1) pengelompokkan yang tidak disupervisi (unsupervised pattern recognition) seperti analisis komponen utama (principle component analysis,
PCA), analisis kluster (cluster analysis); dan (2) pengelompokkan yang disupervisi (supervised pattern recognition) seperti analisis diskriminan (discriminant analysis) (Rohman, 2014).
Menurut Rohman (2014) Dalam teknik spektroskopi, intensitas harus diperlakukan sebagai variabel tergantung dan konsentrasi sebagai variabel bebas. Suatu teknik yang disebut dengan regresi linier biasa dapat digunakan untuk menemukan serangkaian persamaan regresi yang menghubungkan antara absorbansi (At) pada tiap bilangan gelombang dengan konsentrasi analit. Dengan mengasumsikan bahwa absorbansi pada tiap gelombang adalah jumlah dari absorbansi pada tiap individual komponen, maka persamaan regresi dapat berbentuk = + + + ⋯ + yang mana koefisien untuk setiap komponen tergantung pada panjang gelombang.
Dalam prakteknya, model aditif/penjumlahan sederhana ini tidak dapat menggambarkan keadaan sebenarnya secara sempurna. Terdapat dua alasan untuk hal ini. Pertama, analit yang dikehendaki dapat terganggu dengan satu sama lain secara kimiawi sedemikian rupa sehingga akan mempengaruhi spektra analit yang dituju. Kedua, sampel dari sumber sebenarnya dapat mengandung senyawa lain selain senyawa-senyawa (analit) yang akan dianalisis, yang berkontribusi pada nilai absorbansi yang dihasilkan. Pada keadaan ini, lebih baik menggunakan suatu kalibrasi terbalik dan mengkalibrasi dengan spesimen sebenarnya. Istilah “kalibrasi terbalik” berarti bahwa konsentrasi analit (Ct) dimodelkan sebagai fungsi spektrum (yakni sebagai kebalikan kalibrasi klasik). Dengan demikian persamaan regresi terbalik mempunyai bentuk: = + + + ⋯ + . Kalibrasi terbalik merupakan kalibrasi yang sesuai karena konsentrasi tidak dipertimbangkan sebagai variabel terkendali (Rohman, 2014).
Berdasarkan hal di atas, seringkali kalibrasi multivariat dibedakan menjadi: (1) kalibrasi biasa/normal ( = + + + ⋯ + ), dan metode yang termasuk jenis ini adalah metode kuadrat terkecil klasik (classical least square) dan (2) kalibrasi terbalik ( = + + + ⋯ + . Yang termasuk dalam kalibrasi terbalik adalah: (i) stepwise multiple linear regression, (ii) principle component regression, dan (iii) partial least square
(Rohman,2014).
Partial least-squares (PLS) merupakan perkembangan metode least square regression (LSR). Di dalam metode PLS, dicari variabel baru dari populasi data dalam bentuk matrik data. Variabel baru ini terbentuk dari kombinasi antar
koordinat matrik data. Variabel ini kemudian disebut dengan “latent variable” (Land et al., 2011). Metode ini menggunakan suatu kombinasi linier dari variabel prediktor daripada menggunakan variabel biasa. Variabel yang memberikan korelasi tinggi terhadap variabel response dipilih karena akan memberikan prediksi yang lebih efektif. Dalam hal ini, PLS membuat suatu kombinasi linier dari variabel prediktor yang memberikan korelasi yang tinggi terhadap variabel response dan juga menjelaskan variasi di dalam variabel respons (Miller, 2010). “Latent variabel” ini diperoleh dari dua tahapan penting yaitu loading weight dan
regression coofesion. Loading weight adalah proses seleksi variabel-variabel dengan nilai korelasi yang signifikan, proses ini menitik beratkan pada pemberian suatu nilai loading weightpada setiap variabel yang bisa diseleksi berdasarkan nilai tetapan signifikansi dari uji Hotelling’s T2 yang dikombinasikan dengan Jacknifing. Dari proses ini dapat diperoleh variabel-variabel yang memberikan pengaruh kuat dan bertanggung jawab terhadap kemampuan prediksi dari model. Proses kedua adalah regression coofesion, tahap ini merupakan tahap yang sangat rumit. Sekali lagi, variabel-variabel yang telah diseleksi dengan Loading Weigh diberikan nilai yang diperoleh dari prosedur bootstrapping atau jackknifing. Nilai regression coofesion adalah nilai yang menghubungkan antara variabel dan response. Nilai ini bertanggung jawab secara langsung untuk proses prediksi (Mehmood et al., 2012). Persamaan linear PLS dinotasikan sebagai berikut :
= � + � (3)
Keterangan :
X = indikator dari variabel eksogen. Y = indikator dari variabel endogen. β = “latent variabel” atau koefisien.
ε = kesalahan pengukuran pemodelan.
(Haenlein, 2004). Kelebihan metode PLS dibandingkan dengan metode kalibrasi lain adalah: a. Dibandingkan dengan LSR, PLS jauh lebih cepat dan lebih mudah diimplementasikan. Kemungkinan terjadinya over-fitting pada PLS jauh lebih kecil dibandingkan dengan metode kalibrasi lain.
b. PLS memiliki kemampuan tinggi ketika diterapkan pada data dengan dimensi yang luas.
(Land et al., 2011).
D. Validasi Metode Analisis