BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Teh hijau diperoleh dari Perkebunan Teh Rumpun Sari Medini Boja, Kabupaten Kendal, Jawa Tengah dan diolah tanpa mengalami proses fermentasi, tidak mengalami oksidasi enzimatik untuk menjaga senyawa aktif yang terkandung di dalamnya. Identifikasi teh hijau dilakukan oleh Perkebunan Teh Rumpun Sari Medini Boja, Kabupaten Kendal, Jawa Tengah untuk menyatakan bahwa daun yang digunakan adalah benar daun teh (Camellia sinensis L.) yang diolah menjadi teh hijau.
2. Pembuatan serbuk dan infusa teh hijau
Teh hijau yang diperoleh dari Perkebunan Teh Rumpun Sari Medini Boja, Kabupaten Kendal, Jawa Tengah kemudian dibuat serbuk dan diolah menjadi infusa teh hijau di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada berdasarkan prosedur kerja yang dilakukan oleh LPPT UGM Yogyakarta.
3. Uji kemurnian isolat bakteri uji dan identifikasi bakteri uji
Isolat bakteri ujiS. mutansyang berasal dari Laboratorium Mikrobiologi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta digoreskan ke dalam 3 cawan petri berisi Nutrien Agar (NA) secara streak plate sebanyak 3 kali reisolasi untuk uji kemurnian isolat, sehingga diperoleh isolat bakteri yang benar-benar murni ditunjukkan dengan koloni-koloni yang terpisah dan homogen pada seluruh bagian cawan petri. Diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 370C. Setelah inkubasi dan didapatkan koloni terpisah dan homogen yang ditunjukkan oleh bentuk koloni, ukuran diameter, dan warna koloni yang sama, dilakukan isolasi kembali dengan digoreskan dalam media NA miring dan NB sebagai stok kultur murni bakteri uji.
Identifikasi bakteri uji pertama kali dilakukan dengan uji pengecatan Gram dengan reagen cat Gram A (Kristal violet), Gram B (Larutan iodine), Gram C (Alkohol 96%), dan Gram D (Safranin) dari media Nutrien Agar (NA) miring tersebut untuk mengetahui sifat Gram dan bentuk sel bakteri uji. Kemudian, dilanjutkan uji biokimiawi meliputi uji Katalase, Oksidasi-Fermentasi (O-F),
media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) terkait karakter Streptococcus mutans
berdasarkan buku panduan determinasi bakteri (Holt,et al., 2000).
a. Uji katalase. Satu sampai dua tetes 30% H2O2 diletakkan pada gelas benda, kemudian ditambahkan 1 ose atau 2-3 tetes suspensi isolat murni bakteri uji. Katalase positif ditandai dengan pembentukan buih seketika, dibandingkan dengan kontrol. S. mutans bersifat katalase negatif berdasarkan buku panduan determinasi bakteri (Holt,et al., 2000).
b. Uji Oksidasi-Fermentasi (O-F). Isolat murni bakteri uji diinokulasikan dalam 4 tabung berisi media O-F yang mengandung 1% dekstrosa (karbohidrat). Tabung 1 ditutup dengan parafin lunak, tabung 2 tidak ditutup parafin, tabung 3 digunakan sebagai kontrol ditutup parafin, dan tabung 4 digunakan sebagai kontrol yang tidak ditutup parafin, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C, dan perlakuan dibandingkan dengan kontrol. Proses oksidasi terjadi pada bakteri aerob dan fermentasi pada bakteri anaerob. Hasil positif jika terjadi perubahan warna dari hijau menjadi kuning baik pada tabung 1 dan tabung 2 yang menunjukkan bakteri uji melakukan metabolisme dekstrosa secara oksidasi maupun fermentasi menjadi asam (fakultatif anaerob).S. mutansbersifat fakultatif anaerob berdasarkan buku panduan determinasi bakteri (Holt,et al., 2000).
c. Uji Methyl Red (MR). Isolat murni bakteri uji diinokulasikan dalam tabung berisi media MR-VP, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Setelah masa inkubasi, ditambahkan beberapa tetes reagen metil merah. Larutan dikocok dengan hati-hati. Perubahan warna dibaca setelah 30 menit. Hasil positif jika terjadi perubahan warna menjadi merah setelah 30 menit penambahan reagen.
S. mutans membentuk asam dari proses fermentasi glukosa (Uji MR positif) berdasarkan buku panduan determinasi bakteri (Holt,et al., 2000).
d. UjiVoges Proskauer (VP). Isolat murni bakteri uji diinokulasikan dalam tabung berisi media MR-VP, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Setelah masa inkubasi, ditambahkan 0,6 mL larutan alpha-naphtol 5% dilanjutkan 0,2 mL KOH 40%. Larutan dikocok dengan hati-hati, dilonggarkan tutupnya, dan dikocok kembali, diulangi setiap 5 menit. Perubahan warna dibaca setelah 30 menit. Hasil positif jika terjadi perubahan warna menjadi merah setelah 30 menit penambahan reagen. S. mutans membentuk asam dari proses fermentasi glukosa (Uji VP positif) berdasarkan panduan determinasi bakteri (Holt,et al., 2000).
e. Uji fermentasi karbohidrat dalam mediaTriple Sugar Iron Agar (TSIA). Isolat murni bakteri diinokulasikan dalam tabung berisi media TSIA secara tusukan menggunakan jarum inokulasi dan streak menggunakan jarum ose. Perubahan warna media TSIA dari merah-orange menjadi kuning menunjukkan adanya fermentasi laktosa, sukrosa, dan dekstrosa dibandingkan dengan kontrol.
S. mutansmembentuk asam dari proses fermentasi laktosa, sukrosa, dan dekstrosa (Uji TSIA positif) berdasarkan panduan determinasi bakteri (Holt,et al., 2000). 4. Uji sterilitas infusa teh hijau
Sebanyak 0,1 mL infusa teh hijau dari setiap konsentrasi diambil, kemudian dispreaddi atas permukaan media, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C untuk uji sterilitas infusa teh hijau. Sterilitas ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan mikroba dalam infusa teh hijau dari setiap konsentrasi tersebut.
5. Pembuatan variasi konsentrasi EGCG dalam infusa teh hijau
Tujuh variasi konsentrasi EGCG dalam infusa teh hijau dibuat dengan modifikasi variasi konsentrasi berdasarkan pengembangan konsentrasi dari penelitian sebelumnya yang pernah dilakukan dan memberikan hasil nilai KHM 0,5 mg/ mL dan KBM sebesar 1,0 mg/ mL (Pratikno, 2003), yaitu 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2,5; 5; dan 7,5 mg/ mL dengan volume 14 mL.
Tabel I. Variasi konsentrasi EGCG dalam infusa teh hijau untuk uji potensi antibakteri dengan metode difusi paper disc(LPPT UGM, 2011)
Konsentrasi EGCG infusa teh hijau
(mg/ mL)
Volume infusa teh hijau yang digunakan
(mL)
Volume aquadest yang ditambahkan
(mL)
Volume akhir infusa teh hijau yang diinginkan (mL) 0,25 5 9 14 0,5 10 4 14 0,75 15 0 14 1 20 0 14 2,5 50 0 14 5 100 0 14 7,5 150 0 14
6. Uji potensi antibakteri infusa teh hijau dengan berbagai variasi konsentrasi EGCG dengan metode difusipaper disc
a. Pembuatan media Nutrien Agar (NA). Sebanyak 3 gbacteriological agar
dan 2 g NB dilarutkan dalam 125 mL aquadest steril. Larutan dipanaskan dengan sesekali diaduk hingga jernih dan terlarut sempurna. Larutan tersebut kemudian diautoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Selanjutnya media dibiarkan agak dingin dan siap untuk digunakan.
b. Pembuatan suspensi bakteri uji. Kultur murni S. mutans sebanyak 1 mL diinokulasikan ke dalam media cair NB, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Kekeruhan media NB dibandingkan dengan kekeruhan larutan standar
Mc. Farland II (6.108 CFU/ mL). Apabila kekeruhan kultur bakteri uji dalam NB tidak setara, maka dapat ditambahkan NB steril hingga kekeruhannya setara dengan larutan standar Mc. Farland II (6.108CFU/ mL).
c. Uji potensi antibakteri infusa teh hijau dengan berbagai variasi konsentrasi EGCG dengan metode difusi paper disc. Kontrol positif berupa standar baku EGCG dengan variasi konsentrasi 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2,5; 5; dan 7,5 mg/ mL, dan senyawa perlakuan berupa infusa teh hijau dengan variasi konsentrasi EGCG yang sama, yakni 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2,5; 5; dan 7,5 mg/ mL.
Diambil tabung reaksi yang berisi 15 mL media NA, dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan memadat sebagai kontrol kontaminasi media. Diambil tabung reaksi yang berisi 15 mL media NA, ditambahkan dengan 1 mL suspensi bakteri S. mutans untuk kemudian diinokulasikan dalam media NA secara pour plate, dimasukkan dalam cawan petri, dan dibiarkan memadat sebagai kontrol pertumbuhan bakteri uji. Diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 370C bersama dengan perlakuan.
Diambil tabung reaksi yang berisi 15 mL media NA, ditambahkan dengan 1 mL suspensi bakteri S. mutansuntuk kemudian diinokulasikan dalam media NA secara pour plate, dan dibiarkan memadat. Dua puluh lima µL (25 µL) kontrol positif senyawa baku EGCG dengan variasi konsentrasi 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2,5; 5; dan 7,5 mg/ mL diinokulasikan dalam paper disc yang diletakkan dalam 4 kuadran di cawan petri. Diinokulasikan 25 µL aquadest padapaper discdi tengah cawan petri sebagai kontrol negatif (aquadest). Diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 370C bersama perlakuan.
Diambil tabung reaksi yang berisi 15 mL media NA, ditambahkan dengan 1 mL suspensi bakteri S. mutansuntuk kemudian diinokulasikan dalam media NA secarapour plate, dan dibiarkan memadat. 25 µL senyawa uji perlakuan infusa teh hijau dengan variasi konsentrasi EGCG 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2,5; 5; dan 7,5 mg/ mL diinokulasikan dalampaper disc, yang diletakkan dalam 4 kuadran dan satupaper disc di tengah cawan petri sebagai kontrol negatif (aquadest). Dibuat replikasi sebanyak 6 kali replikasi. Diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 370C. Parameter yang diamati adalah diameter zona hambat yang dihasilkan oleh senyawa uji infusa teh hijau dengan variasi konsentrasi 0,25; 0,5; 0,75; 1; 2,5; 5; dan 7,5 mg/ mL dan kontrol negatif (aquadest) dengan diukur menggunakan penggaris.
7. Penentuan nilai KHM dan KBM dengan metode dilusi cair
a. Pembuatan infusa teh hijau dengan berbagai variasi konsentrasi EGCG untuk uji potensi antibakteri dengan metode dilusi cair. Dibuat infusa teh hijau dengan berbagai variasi konsentrasi EGCG untuk uji potensi antibakteri dengan metode dilusi cair dengan konsentrasi 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 2; 3; 4; 5 dan 6 mg/ mL.
Tabel II. Variasi konsentrasi EGCG dalam infusa teh hijau untuk uji potensi antibakteri dengan metode dilusi cair
Konsentrasi EGCG dalam infusa teh hijau (mg/ mL) Volume infusa teh hijau yang digunakan (mL) Volume aquadest yang ditambah (mL) Volume infusa teh hijau yang diinginkan (mL)
Keterangan pengambilan sampel
0,1 0,4 0,6 1 Pengenceran dari EGCG 0,25 mg/ mL
0,2 0,8 0,2 1 Pengenceran dari EGCG 0,25 mg/ mL
0,3 0,6 0,4 1 Pengenceran dari EGCG 0,5 mg/ mL
0,4 0,8 0,2 1 Pengenceran dari EGCG 0,5 mg/ mL
0,5 1 0 1 Dari larutan stok
0,6 0,8 0,2 1 Pengenceran dari EGCG 0,75 mg/ mL
0,7 0,7 0,3 1 Pengenceran dari EGCG 1 mg/ mL
0,8 0,8 0,2 1 Pengenceran dari EGCG 1 mg/ mL
0,9 0,9 0,1 1 Pengenceran dari EGCG 1 mg/ mL
1 1 0 1 Dari larutan stok
2 0,4 0,6 1 Pengenceran dari EGCG 5 mg/ mL
3 0,6 0,4 1 Pengenceran dari EGCG 5 mg/ mL
4 0,8 0,2 1 Pengenceran dari EGCG 5 mg/ mL
5 1 0 1 Dari larutan stok
6 0,8 0,2 1 Pengenceran dari EGCG 7,5 mg/ mL
b. Pembuatan blanko. Diambil 15 tabung reaksi yang masing-masing berisi 15 mL media NB dan ditambahkan masing-masing 1 mL infusa teh hijau dengan variasi konsentrasi baru EGCG yang sudah dibuat 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 2; 3; 4; 5; dan 6 mg/ mL, kemudian diinkubasikan pada suhu 370C selama 24 jam. Pembuatan blanko ini digunakan sebagai blanko untuk perlakuan uji penentuan nilai KHM dan KBM dengan metode dilusi cair (tahap c).
c. Uji penentuan nilai KHM dan KBM dengan metode dilusi cair. Diambil 15 tabung reaksi yang masing-masing berisi 15 mL media NB dan ditambahkan masing-masing 1 mL infusa teh hijau dengan variasi konsentrasi EGCG baru yang sudah dibuat 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 2; 3; 4; 5; dan 6 mg/ mL, kemudian ditambahkan pula masing-masing 1 mL suspensi bakteri S. mutans
dalam setiap tabung reaksi untuk selanjutnya diinkubasikan pada suhu 370C selama 24 jam. Setelah masa inkubasi, dilakukan pembacaan nilai OD dengan
mengamati selisih nilai absorbansi yang muncul dari perlakuan uji penentuan nilai KHM dan KBM dengan metode dilusi cair dan blanko (tahap b) dengan spektrofotometrivisible.
d. Penegasan penentuan KHM dan KBM dengan metode streak plate. Dilakukan uji penegasan hasil dengan menginokulasikan tabung reaksi perlakuan (tahap c) dengan nilai OD = 0 pada uji penentuan nilai KHM dan KBM dengan metode dilusi cair dalam media NA secara streak plate. Dilakukan pengamatan setelah masa inkubasi 24 jam pada suhu 370C. Setelah inkubasi, nilai KHM dan nilai KBM ditentukan sebagai berikut: jika pada media agar uji penegasan masih terdapat pertumbuhan bakteri pada konsentrasi terkecil yang membunuh semua bakteri S. mutans berdasarkan nilai OD = 0 pada pengukuran spektrofotometer, maka konsentrasi infusa EGCG infusa teh hijau tersebut dinyatakan sebagai KHM. Jika pada media agar tidak terdapat pertumbuhan bakteri S. mutans sama sekali pada konsentrasi terkecil yang membunuh semua bakteri S. mutans
berdasarkan nilai OD = 0 pada pengukuran spektrofotometer, maka konsentrasi EGCG infusa teh hijau tersebut dinyatakan sebagai KBM (McKane dan Kandel, 1996).