putih
S
prague Dawley(SD)diabetes
melitus.
2.METODE PENELITIAN
Penelitian ini telah mendapatkan Keterangan Kelaikan Etik (Ethical Clearance) FK Universitas Udayana/RSUP Sanglah Denpasar, Bali dengan Nomor: 289/UN.14.2/Litbang/2014. Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap yaitu: penentuan kapasitas antioksidan tertinggi berbagai fraksi pelarut dandosis minuman sinom untuk mengetahui efek terhadap penurunangula darah puasa tikus putih Sprague Dawley diabetes melitus
.
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas bahan baku dan bahan kimia. Bahan baku yaitu rimpang kunyit yang
65
diperoleh dari pasar tradisional Badung, Denpasar, Bali, daun asam yang masih muda dari pucuk daun sampai helai daun ke-tujuh dari daerah Buduk, Mengwi, Badung, Bali. Bahan kimia yang digunakan terdiri atas pelarut heksana, kloroform, etil asetat ( PA merek Emsure Acs 215), kertas saring (Whatman no.1), asam askorbat, H2SO4, DPPH (Merck),
methanol (Merck).Bahan yang digunakan dalam penelitian tahap II ini adalah fraksi pelarut dengan kapasitas antioksidan tertinggi berbagai dosis minuman sinom, tikus putih
Sprague Dawley dari Balai Veteriner Farmako Surabaya, aquades, pakan tikus standar. Peralatan yang digunakan adalah timbangan analitik, timbangan digital, spektrofotometer merek Shimadzu UV-160, rotary vacum evaporator, labu pisah, aluminium foil, Erlenmeyer 250 ml (Pyrex), tabung reaksi (Pyrex), kain saring, gelas ukur 100 ml, pipet volume, pipet tetes, pipet mikro, bea ker gla ss
500 ml (Pyrex), labu takar, vortex, magnetic stirrer, spuit sonde 2,5 cc, blood glucose test meter (merk Nesco), Botol gelap, Glucose Stick (merk Nesco), sarung tangan, masker, kandang tikus ukuran 15x 15 cm lengkap dengan tempat makan dan minum, gunting.
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Rat For Research analitik Bukit Jimbaran Bali, Laboratorium Animal Unit bagian Farmakologi, Laboratorium Pengolahan Pangan Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana. Penelitian dilakukan bulan Januari 2013 sampai dengan bulan Maret 2014.
Penelitian ini dimulai dengan penyiapan minuman sinom dilakukan dengan cara: rimpang dikupas, ditimbang sebanyak 50 gram, dicuci, diblender dengan menambahkan 400 ml air selama 3,5 menit kemudian disaring dipanaskan sampai mendidih, selama 1 menit. Filtrat yang diperoleh disebut filtrat kunyit. Filtrat daun asam muda yang dibuat dengan cara ditimbang seberat 250 gram daun asam muda, ditambahkan 300 ml air, kemudian dipanaskan sampai mendidih selama 1 menit. Minuman sinom dimasukan ke dalam botol kaca, siap digunakan untuk pengujian. (Mulyani, et al., 2014)
Fraksinasi minuman sinom dengan menggunakan pelarut heksana, kloroform, dan etil asetat dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Kelompok, dilakukan dengan cara berikut: 100 ml minuman sinom
dimasukan ke dalam labu pisah, selanjutnya ditambahkan pelarut n- heksana 100 ml dikocok 10 kali dan didiamkan selama 30 menit. Fraksi n-heksana dipisahkan selanjutnya dievaporasi pada suhu 45oCdan tekanan 280
mbar untuk menghilangkan pelarut. Fraksi air difraksinasi lagi berturut-turut dengan pelarut kloroform, dan etil asetat, dengan cara yang
sama
seperti di atas. Pada tahap ini diperoleh 4 fraksi yaitu : fraksi heksana, fraksi kloroform, fraksi etil asetat dan fraksi air, yang akan dianalisis kapasitas antioksidannya. Fraksi dengan kapasitas antioksidan tertinggi digunakan untuk pengujian penentuan dosis. Penentuan standar uji kapasitas antioksidan digunakan asam askorbat sebagai pembanding kontrol positip yang dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol dengan konsentasi 0, 10, 20, 40, 60, 80, dan 100 ppm. Larutan DPPH yang digunakan disiapkan dengan menggunakan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mM.Proses pembuatan larutan DPPH 1 mM dilakukan dalam kondisi suhu rendah 27oC danterlindung dari cahaya matahari. Absorbansi larutan blanko diukur untuk melakukan persen inhibisi. Larutan blanko dibuat dengan mereaksikan 0.5 ml pelarut metanol dengan 3.5 ml larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi tertutup.
Uji kapasitas antioksidan fraksi minuman sinomWinarsi(2007) dilakukan dengancara: masing-masing fraksi minuman
sinom ditimbang sebanyak 1 g kemudian dilarutkan dalam metanol 100% sebanyak 10 ml, lalu divortex dan disaring. Fraksi minuman
sinom dan larutan DPPH yang telahdibuat, masing-masing diambil 0.5 ml, dan kemudian direaksikan 3,5 ml larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi tertutup yang berbeda yang telah diberi label. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit dan diukur absorbansinya dengan
66
menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm. Setelah itu, aktivitas antioksidan dari masing – masing sampel dinyatakan dengan persen inhibisi yang dihitung dengan rumus berikut:
Regresi : Y= ax + b.
Rumusnya (ppmAAEAC) =
konsntrasi(ppm) x Tv x Fp x1000.000
W sampel (mg)
Keterangan : Tv = total volume (liter), Fp = faktor pengeceran, Konsentrasi = hasil penghitungan kurva standar, AAEAC=
Ascorbic Acid Equivalent Antioksidan Capacity.
Persiapan uji secara in vivo dilakukan dengan memberikan pakar standar pada tikus mengacu pakan standar America Institute of Nutrition
(AIN 1976) yang sesuai dengan kebutuhan gizi tikus. Komposisi pakan standar dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Komposisi pakan standar tikus (AIN, 1976)
Bahan Penyusun Jumlah (%) Protein (kasein)
Lemak (minyak jagung) Selulosa (ampas tebu) Campuran vitamin Campuran mineral Karbohidrat (maizena) Air (aqua) 20 5 5 1 3.5 55.5 10 Total 100
Pakan standar dengan acuan di atas didapatkan dengan cara membeli pada toko makanan hewan dengan tipe makanan tikus 521 yang sebelumnya sudah diproses. Hasil proses pakan sudah dalam wujud pelet dengan bentuk silinder panjang dan dikeringkan dalam oven pada suhu 50 oC selama 12 jam. Persiapan
hewan coba. Hewan coba yang digunakan adalah tikus Sprague Dawley (SD) jantan dewasa berumur dua bulan, dengan berat rata- rata 210 gr - 250 gr sebanyak 25 ekor, yang diperoleh dari Balai Veteriner Farmako Surabaya. Tikus tersebut dimasukkan dalam kandang individu dengan ukuran panjang 150 cm x lebar 15cm x tinggi 15 cm yang telah
dilengkapi tempat makan dan minum dan setiap kandang ditempati satu ekor tikus. Tikus kemudian dikelompokan menjadi 5 kelompok sesuai rancangan penelitian. Setiap kelompok terdiri dari 4 ekor sebagai ulangan sehingga total tikus adalah 20 ekor. Semua tikus ditempatkan dalam ruang yang bersih, suhu nyaman ± 23oC, kondisi gelap terang secara
alami. Sebelum tikus diberi perlakuan ada masa adaptasi selama 7 hari dengan diberi makan pakan standar dan minum secara ad libitum. Pemberian makan dilakukan pagi hari dari jam 7.00-8.00 WITA, sebanyak 20 gram, setiap hari ditimbang berat badannya.
Pembuatan tikus diabetes melitusAndayani (2003) dilakukan dengan memeliharatikus dalam kandang selama 7 hari untuk menyeragamkan cara hidup dan makanannya, makanan dan minuman diberikan secara ad libitum. Kesehatan tikus dipantau setiap hari, dan berat ditimbang setiap hari. Bila ada sakit akan diobati oleh dokter hewan. Setelah masa adaptasi selama 7 hari, selanjutnya dilakukan pengukuran kadar glukosa darah. Sebelum dilakukan pengukuran kadar glukosa darah, tikus dipuasakan terlebih dahulu selama 16 jam. Induksi dilakukan dengan menggunakan 5 % larutan streptocotozin (STZ) dalam larutan asam sitrat dan natrium sitrat 0,9% dengan dosis 50 mg/kg BB secara intraperitonial (Andayani, 2003). Setelah hewan diinduksi, diberi makanan yang cukup (ad libitum) dan dalam waktu 24 jam pertama dalam air minumnya ditambahkan 5 % larutan D-glukosa monohidrat untuk mencegah terjadinya hipoglikemia yang fatal. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan 3 hari setelah induksi. Tikus dikatakan DM jika kadar glukosa darah puasa > 126 mg /dl atau kadar gula sesaat > 135 mg/dl, Glukosa darah tikus normal 109 mg/dl.
Penetapan dosis dan persiapan fraksi minuman
sinomdilakukan dengan cara :dosis yang diberikan adalah dosis lazim konsumsi suplemen per hari pada manusia yang dikonversi dari manusia ke tikus. Perhitungan
pemberian dosis berdasarkan pada “body
surface area” (BSA) mengikuti penelitian
67
(2007). Rumus konversi dosis disajikan sebagai berikut :
HED (mg/kg) =
animal dose (mg/kg) X animal Km/ human Km
Diasumsikan suplemen antioksidan perhari pada manusia rata-rata sebesar 500 mg/60 kg BB, maka HED (human equivalent dose) (mg/kg) = 8,3. Apabila dikonversi ke tikus maka perhitungan menjadi :
8,3 mg/kg = animal dose (mg/kg BB) X 6/37 Animal dose = 8,3 X 37/6
= 51,2 mg/kg BB
Berdasarkan perhitungan di atas, maka dosis yang diberikan untuk tikus bervariasi dari 50 mg, 100 mg, 150 mg, dan 200 mg per kilogram berat badan tikus. Fraksiair minuman sinom
sudah ditimbang beratnya sesuai dengan dosis yang akan diberikan pada tikus dilarutkan di dalam 5 ml aquades kemudian di vortek agar tercampur dengan merata. Pemberian fraksi air minuman sinom dengan cara ini bertujuan untuk mempermudah pemberian pada tikus putih secara oral yang diberikan sesuai dengan masing-masing dosis fraksi setiap pagi pada jam 07.30 – 08.00 WIB dan siang jam 12.00- 13.00 WIB
Penentuan perlakuan dosis dilakukan secara
bioassay menggunakan 20 ekor tikus putih
Sprague Dawley dengan perlakuan dosis pemberian fraksi air minuman sinom
penelitian tahap I yang terdiri dari 5 taraf yaitu: diberikan fraksi air 0 mg/kg BB atau diberi aquades 5 ml/ekor, disebut sebagai kontrol negatif (K0), diberikan secara oral (disonde) dengan fraksi air minuman sinom (K1) sebesar 50 mg/kg BB ditambah aquades 5 ml/ekor, diberikan secara oral (disonde) dengan fraksi air minuman sinom (K2) 100 mg/kg BB/hari ditambah aquades 5 ml/ekor/hari, diberi secara oral (sonde) dengan fraksi air minuman sinom
(K3) 150 mg/kg BB ditambah aquades 5 ml/ekor, diberi secara oral (sonde) dengan fraksi air minuman sinom (K4) 200 mg/kg BB ditambah aquades 5 ml/ekor, dari fraksi air minuman sinom yang telah ditambahkan 5 ml aquades diberikan 2 kali sehari pagi dan